Ｉｎ ｓｉｔｕ計測による脂質、膜受容体の活性化機構の解明

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: 過渡的複合体が関わる生命現象の統合的理解－生理的準安定状態を捉える新技術－
• 研究課題/領域番号: 21121006
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 白川 昌宏 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (00202119)
• 研究分担者: 森川 耿右 公益財団法人国際高等研究所, その他部局等, 名誉教授 (80012665)
• 研究期間 (年度): 2009-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: NMR / 脂質シャペロン / 脂肪酸結合蛋白質

研究実績の概要

本研究ではin-cell NMRを用いて、細胞内で形成される蛋白質複合体の構造や運動性・安定性をその場 (in situ) 観察・計測する手法の開発を目指した。
・脂肪酸シャペロン蛋白質FABP4の解析
リガンド結合により活性化された蛋白質はしばしば過渡的で不安定なためin vitroでの解析が困難であるので、細胞内等、in situで蛋白質の構造を観察する必要がある。モデル系として、FABP(Fatty Acid Binding Protein)4を用い、in-cell NMRによる細胞内での動的状態の解析を行うための準備として、まずin vitroで解析した。FABP4は細胞内における脂肪酸輸送に関与する蛋白質で、遊離脂肪酸や類縁体と結合し細胞内の特定部位に移動する。試験管内でのNMR緩和時間測定から、基質非結合状態でFABP4のhelix-loop-helix (HLH)領域がミリ秒の時間スケールで複数の立体構造間で有意に揺らいでいること、更にモデル基質であるANS(1,8-anilinonaphthalene sulfonate)の結合によりこの揺らぎが抑制されることがわかった。またANS結合によってHLHとは異なる部位で運動性の上昇が見られた。この構造揺らぎは、核内移行に際し、或いは移行後の他分子との相互作用を促進するものである可能性がある。
・in-cell 19F-NMR
より簡便・高感度なin-cell NMR法を目指し、19F-NMRの適用を試みた。免疫抑制剤FK506結合蛋白質(FKBP12)のフェニルアラニンを19F標識し、in-cell 19F-NMR測定を行ったところ、HeLa細胞内で良好な1次元スペクトルを得る事ができ、外部投与のFK506やラパマイシンとの結合も容易に検出できることが示された。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] The unexpected role of polyubiquitin chains in the formation of fibrillar aggregates. (2015)
  • 著者名/発表者名: Morimoto D,Walinda E, Fukada H, Sou YS, Kageyama S, Hoshino M, Fujii T, Tsuchiya H, Saeki Y, Arita K, Ariyoshi M, Tochio H, Iwai K, Namba K, Komatsu M, Tanaka K, Shirakawa M.
  • 雑誌名: Nat Commun. 巻: 6 ページ: 6116-6116
  • DOI: 10.1038/ncomms7116.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Functional assessment of the mutational effects of human IRAK4 and MyD88 genes. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto T, Tsutsumi N, Tochio H, Ohnishi H, Kubota K, Kato Z, Shirakawa M, Kondo N
  • 雑誌名: Mol Immunol. 巻: 58 ページ: 66-76
  • DOI: 10.1039/c3cc39205h
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Quantitative comparison of protein dynamics in live cells and in vitro by in-cell (19)F-NMR. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takaoka Y, Kioi Y, Morito A, Otani J, Arita K, Ashihara E, Ariyoshi M, Tochio H, Shirakawa M, Hamachi I.
  • 雑誌名: Chem Commun 巻: 49 ページ: 2801-2803
  • DOI: 10.1039/c3cc39205h
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Pruning the ALS-associated protein SOD1 for in-cell NMR. (2013)
  • 著者名/発表者名: Danielsson J, Inomata K, Murayama S, Tochio H, Lang L, ＊Shirakawa M, ＊Oliveberg M
  • 雑誌名: J Am Chem Soc. 巻: 135 ページ: 10266-10269
  • DOI: 10.1021/ja404425r
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Development of fluorogenic probes for quick no-wash live-cell imaging of intracellular proteins. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hori Y, Norinobu T, Sato M, Arita K, Shirakawa M, ＊Kikuchi K.
  • 雑誌名: J Am Chem Soc. 巻: 33 ページ: 12360-12365
  • DOI: 10.1021/ja405745v
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] An in-cell NMR study of monitoring stress-induced increase of cytosolic Ca2+ concentration in HeLa cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Dambarudhar Shiba Sankar Hembrama, Takahiro Haremakia, Jumpei Hamatsua, Jin Inouea, Hajime Kamoshidaa, Teppei Ikeyaa, Masaki Mishimaa, Tsutomu Mikawab, Nobuhiro Hayashic, Masahiro Shirakawad, Yutaka Ito
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 438 ページ: 653-659
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.07.127.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] DNAメチル化の構造生物学とin-cell NMRによる細胞内でのタンパク質と薬剤の相互作用の観察 (2014)
  • 著者名/発表者名: 白川 昌宏
  • 学会等名: 日本薬学会医薬化学部会第32回メディシナルケミストリーシンポジウム
  • 発表場所: 神戸国際会議場
  • 年月日: 2014-11-27 – 2014-11-27
  • 招待講演