生体反応場の高特異性の解析と機能制御

2014 年度 実績報告書

• 研究領域: 直截的物質変換をめざした分子活性化法の開発
• 研究課題/領域番号: 22105012
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 城 宜嗣 独立行政法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 主任研究員 (70183051)
• 研究期間 (年度): 2010-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 一酸化窒素 / 人工酵素系 / 酵素機能変換 / 分子進化

研究実績の概要

ホストを大腸菌から緑膿菌に代える事により、今まで成功していなかった、一酸化窒素還元酵素NORの発現系作成に成功した。NOR遺伝子をノックアウトした緑膿菌は、脱窒条件下（硝酸イオン存在、嫌気条件）では生育しなかった。これは、亜硝酸還元酵素が産生するNOが消去される事無く細胞内に拡散するためと考えられる。そこに、NORをコードしたプラスミドを導入すると、緑膿菌は生育できるようになった。この発現系からの野生型酵素の生成にも成功しており、この発現系により、金属配位子の変換や金属自身の変換が可能となった。さらに、このin vivo分析系を用いて、従来とは異なる酵素活性を有するNOR変異体のハイスループットスクリーニングが可能となった。
NORによる、N-O結合開裂とN-N結合生成の反応機構を明らかにするために、NORの酵素反応中に現れる短寿命（ミリ秒）反応中間体の電子構造、配位構造を明らかにすることのできる、時分割赤外分光測定器を完成させた。この分光器に、ナノ秒のレーザーを組み合わせ、光照射でNOを発生させるcagedNOを用いて、NORの反応中間体を生成する事にも成功している。さらに、不可逆な酵素反応中に現れる反応中間体のスペクトル測定を可能とするために、微量の試料を用いてスペクトル積算が可能な試料系の作成にも成功し、テスト実験をおこなった。
今後は、SACLAを用いて、この反応中間体の結晶構造解析を行う。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Crystal Structure, Exogenous Ligand Binding and Redox Properties of an Engineered Diiron Active Site in a Bacterial Hemerythrin (2014)
  • 著者名/発表者名: A. Onoda, Y. Okamoto, H. Sugimoto, Y. Takano, S. Hirota, D. Kurtz, Y. Shiro, T. Hayashi
  • 雑誌名: Chem. Comm. 巻: 50 ページ: 3421-3423
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structures of Reduced and Ligand-Bound Nitric Oxide Reductase Provide Insights into Functional Differences in Respiratory Enzymes (2014)
  • 著者名/発表者名: N. Sato, S. Ishii, H. Sugimoto, T. Hino, Y. Fukumori, Y. Sako, Y. Shiro, T. Tosha
  • 雑誌名: PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics 巻: 82 ページ: 1258-1271
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] An in vivo Inhibitory Effect on the Heme Uptake of Pseudomonas aeruginosa by Its Hemophore (HasAp) Carrying Synthetic Metal Complexes (2014)
  • 著者名/発表者名: C. Shirataki, O. Shoji, M. Terada, S. Ozaki, H. Sugimoto, Y. Shiro, Y. Watanabe
  • 雑誌名: Angw. Chem. Int. Ed. 巻: 53 ページ: 2862-2866
  • DOI: 10.1002/anie.200
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Characterization of Quinol-Dependent Nitric Oxide Reductase from Geobacillus Stearothermophilus: Enzymatic Activity and Active Site Structure (2014)
  • 著者名/発表者名: E. Terasaka, N. Okada, N. Sato, Y. Sako, Y. Shiro, T. Tosha
  • 雑誌名: Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics 巻: 1837 ページ: 1019-1026
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Disulfide Bonds Regulate Binding of Exogenous Ligand to Human Cytoglobin (2014)
  • 著者名/発表者名: H. Tsujino, T. Yamashita, A. Nose, K. Kukino, H. Sawai, Y. Shiro, T. Uno
  • 雑誌名: J. Inor. Biochem. 巻: 135 ページ: 20-27
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Palladium-Nanoparticle-Catalyzed 1,7-Palladium Migration Involving C-H Activation, Followed by Intramolecular Amination: Regioselective Synthesis of N1-Arylbenzotriazoles and an Evaluation of Their Inhibitory Activity Towards Indoleamine 2,3-Dioxygenase (2014)
  • 著者名/発表者名: K. Takagi, M. Al-Amin, N. Hoshiya, J. Wouters, H. Sugimoto, Y. Shiro, H. Fukuda, S. Shuto, M. Arisawa
  • 雑誌名: J. Org. Chem. 巻: 79 ページ: 6366-6371
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Activation of Wild-type Cytochrome P450BM3 by the Next Generation of Decoy Molecules: Enhanced Hydroxylation of Gaseous Alkanes and Crystallographic Evidence (2014)
  • 著者名/発表者名: Z. Cong, O. Shoji, C. Kasai, N. Kawakami, H. Sugimoto, Y. Shiro, Y. Watanabe
  • 雑誌名: ACS Catalysis 巻: 5 ページ: 150-156
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structure-function Analyses of Cytochrome P450revI Involved in Reveromycin A Biosynthesis and Evaluation of the Biological Activity of Its Aubstrate, Reveromycin T (2014)
  • 著者名/発表者名: S. Takahashi, S. Nagano, T. Nogawa, N. Kanoh, M. Uramoto, M. Kawatani, T. Shimizu, T. Miyazawa, Y. Shiro, H. Osada
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 289 ページ: 32446-32458
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Generation, Channeling and Decomposition of NO in Bacterial System (2015)
  • 著者名/発表者名: Shiro, Y.
  • 学会等名: “Metals in Biology” Gordon Research Conference
  • 発表場所: Ventura, USA
  • 年月日: 2015-01-25 – 2015-01-30
  • 招待講演
• [学会発表] これからの生物無機化学 ー金属タンパク質の過去と未来ー (2014)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣
  • 学会等名: 第87回日本生化学会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
  • 招待講演
• [学会発表] Generation, Propagation and Decomposition of Nitric Oxide in Bacterial Denitrification (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiro, Y.
  • 学会等名: 18th European Bioenergetics Conference (EBEC 2014)
  • 発表場所: Lisbon, Portugal
  • 年月日: 2014-07-12 – 2014-07-17
  • 招待講演
• [学会発表] Bacterial Nitrite Reductase and Nitric Oxide Reductase; NO Generation, Channeling and Decomposition (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiro, Y.
  • 学会等名: Eighth International Conference on Porphyrins and Phtalocyanines (ICPP8)
  • 発表場所: Istanbul, Turky
  • 年月日: 2014-06-22 – 2014-06-27
  • 招待講演
• [図書] 鉄の事典 (2014)
  • 著者名/発表者名: 藤井 浩、城 宜嗣
  • 総ページ数: 820
  • 出版者: 朝倉書店
• [備考] 理化学研究所 城生体金属科学研究室
  • URL: http://www.riken.jp/biometal/index.htm
• [備考] 兵庫県立大学 脂肪制御Ⅱ研究室
  • URL: http://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html