ズームイン（高精細）とズームアウト（広視野・深部）観察を可能にする革新技術の開発

2014 年度 実績報告書

• 研究領域: 細胞機能と分子活性の多次元蛍光生体イメージング
• 研究課題/領域番号: 22113003
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 宮脇 敦史 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, チームリーダー (80251445)
• 研究分担者: 濱 裕 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 専門職研究員 (30261796) ; 下薗 哲 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (40391982) ; 新野 祐介 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (10584584)
• 研究期間 (年度): 2010-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: イメージング / 蛍光たんぱく質 / 細胞周期 / 細胞内結晶

研究実績の概要

キクメイシ由来の蛍光タンパク質KikGRを材料に、非常に結晶化しやすい変異体Xpa「（Crystalizable and photo-activatable：クリスパ）」を作製した。驚いたことに、生きた細胞の中で大きな結晶を作ることがわかった。Xpaタンパク質を発現する培養細胞をタイムラプスイメージングで観察したところ、細胞質中に広がったXpaタンパク質が一瞬にして集積し、数ミクロン程度のひし形結晶に変身する様子が確認された。結晶を免疫組織学実験および透過型電子顕微鏡観察したところ、リソソームの膜で覆われていることが分かった。その結晶は、生成後にユビキチン、p62、LC3を介する選択的オートファジーによってリソソームへ取り込まれることが明らかとなった。さらに、細胞1個を材料にＸ線回折構造解析を行い、Xpaタンパク質の立体構造を2.9オングストロームの分解能で決定することに成功した。
蛋白質の構造変化を蛍光シグナルに変換して生体現象を可視化する一分子型センサーについて概説した。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）および単一蛍光蛋白質に基づくセンサーを網羅し、その原理と技術進化、最新の応用例について解説した。さらに、新たに開発したYCX2.60を発現するトランスジェニックマウスを作製した。
細胞周期プローブFucciについて、その利用方法をCold spring harbor BOOKS にて概説した。主には、培養細胞のイメージング設定、Fucci トランスジェニックマウス切片の広範囲イメージング法についてプロトコール詳細を示した。また、G1/S transitionに加えてS/G2 transitionを可視化するFucci probe (Fucci4)の開発に成功、培養細胞でのvalidationを行った。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo (2015)
  • 著者名/発表者名: Tsutsui H, Jinno Y, Shoda K,Tomita A, Matsuda M,Yamashita E, Katayama H ,Nakagawa A,Miyawaki A.
  • 雑誌名: Mol. Cell 巻: 58 ページ: 186-193
  • DOI: :10.1016/j.molcel.2015.02.007
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. (2015)
  • 著者名/発表者名: Madisen L, Garner AR, Shimaoka D, Chuong AS, Klapoetke NC, Li L, van der Bourg A, Niino Y, Egolf L, Monetti C, Gu H, Mills M, Cheng A, Tasic B, Nguyen TN, Sunkin SM, Benucci A, Nagy A, Miyawaki A, Helmchen F, Empson RM, Knopfel T, Boyden ES, Reid RC, Carandini M, *Zeng H
  • 雑誌名: Neuron 巻: 85 ページ: 942-958
  • DOI: :10.1016/j.neuron.2015.02.022.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular spies for bioimaging - Fluorescent protein-based probes. (2015)
  • 著者名/発表者名: Miyawaki A, Niino Y.
  • 雑誌名: Mol. Cell 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progressions with fucci technology. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sakaue-Sawano A, Miyawaki A.
  • 雑誌名: Cold Spring Harb Protoc. 巻: 5 ページ: 525-531
  • DOI: :10.1101/pdb.prot080408 Cold Spring Harb Protoc 2014.
  • 査読あり
• [学会発表] Cruising inside cells (2015)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Miyawaki
  • 学会等名: 「細胞機能と分子活性の多次元蛍光生体イメージング」国際シンポジウム
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2015-01-26 – 2015-01-26
• [学会発表] Cruising inside cells (2014)
  • 著者名/発表者名: 宮脇敦史
  • 学会等名: 日本動物遺伝育種学会第15回年次大会
  • 発表場所: 埼玉
  • 年月日: 2014-11-01 – 2014-11-01
  • 招待講演
• [学会発表] Cruising inside cells (2014)
  • 著者名/発表者名: 宮脇敦史
  • 学会等名: 第35回日本肥満学会「肥満症学の知の創造と実践」
  • 発表場所: 宮崎
  • 年月日: 2014-10-25
  • 招待講演
• [学会発表] A Bilirubin-Inducible Fluorescent Protein from Eel Muscle (2014)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Miyawaki, Akiko Kumagai, Ryoko Ando
  • 学会等名: Janelia Conference on Fluorescent Proteins and Biological Sensors IV
  • 発表場所: Janelia Farm, USA
  • 年月日: 2014-09-28 – 2014-10-01
  • 招待講演
• [学会発表] Cruising inside cells (2014)
  • 著者名/発表者名: 宮脇敦史
  • 学会等名: 第57回日本腎臓学会学術総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2014-07-05 – 2014-07-05
  • 招待講演
• [学会発表] Cruising inside Xs (2014)
  • 著者名/発表者名: 宮脇敦史
  • 学会等名: 日本実験動物科学・技術さっぽろ
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 2014-05-16
  • 招待講演