計画研究
様々な環境条件下での植物の持続的成長には，環境変動に対して細胞内恒常性を厳密に維持する機構が不可欠である。シスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)は，植物においてメチオニン生合成の鍵段階を触媒する。メチオニンの生合成はCGSをコードするCGS1遺伝子の翻訳段階で，メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニン(AdoMet)に応答したSer-94コドンでの翻訳停止と共役したCGS1 mRNAの分解によってフィードバック制御される。AdoMetに応答した翻訳停止において，後続のリボソームの追突により数珠つなぎになる。昨年度までに、数珠つなぎになったリボソームの停止位置を同定し，追突したリボソームが非常にタイトにスタックしていることを明らかにした。数珠つなぎになったリボソームの停止状態を明らかにするため，昨年度に引き続き，ピュロマイシンによるペプチジル-tRNAの離脱反応（ピュロマイシン反応）の詳細な解析を行い，数珠つなぎになったリボソームが、翻訳伸長反応の殿段階で停止しているかを考察した。また，Ser-94コドンでの翻訳停止に至る過程でのピュロマイシン反応および，ペジレーションアッセイ法でリボソームの出口トンネル内での新生ペプチドの状態を解析した。さらに，リボソーム大サブユニットのrRNAについて，化学修飾法およびＵＶクロスリンク法による解析を行ない，翻訳停止に至る過程における，リボソーム側の状態の変化の解析も行なった。これら一連の解析により，AdoMetに応答した翻訳停止に至る課程でのmRNA：リボソーム：新生ペプチド複合体の状態の変化を考察した。
2: おおむね順調に進展している
AdoMetに応答してSer-94で翻訳停止が起こると，後続のリボソームがその後ろに数珠つなぎになるが，CGS1 mRNAの分解はエンドヌクレアーゼにより，これら数珠つなぎになったリボソームに対応する位置で切断されると考えられる。一方，通常の翻訳停止においても，翻訳停止に関わる因子の作用には翻訳伸長時よりも時間がかかると考えられており，翻訳終止コドンの後ろにリボソームが数珠つなぎになることが報告されている。しかしながら、こうした，いわば生理的な数珠つなぎ状態では数珠つなぎになったmRNAに対応した位置でのmRNAの切断は報告されていない。同義コドン置換による翻訳停止位置の同定，ピュロマイシン反応によるリボソームの翻訳停止状態の解析，ペジレーションアッセイ法によるCGS新生ペプチドのコンフォメーションの解析，およびrRNAについての化学修飾法ならびにＵＶクロスリンク法によるコンフォメーション変化の解析により得られ結果は，いずれも本研究の研究目的であるAdoMetに応答した翻訳停止とこれがトリガーするmRNA分解が如何にしてもたらされるかを解明する上で，重要な知見である。これらの成果は，J. Biol. Chem.誌に受理されている。また，領域内共同研究による他の応答反応に敷衍した研究を推進する面では，植物のホウ素応答および低温応答におけるmRNA安定性制御についての解析を進めた。
リボソームにおける翻訳伸長の反応は，大きく分けて，（1）アミノアシル-ｔRNAがA部位に入ってくるデコーディング，（2）A部位のアミノアシル-ｔRNAとP部位のペプチジル-ｔRNAの間のペプチド転移反応，（3）リボソームが1コドン進む転座，の3段階からなる。これまでに報告されている翻訳伸長の停止では，いずれもリボソームがペプチド転移反応の段階で停止しているが，AdoMetに応答したCGS1 mRNAの翻訳停止では，リボソームが転座前の段階で停止しており，A部位に翻訳中間産物であるペプチジル-ｔRNAが位置するというユニークな特徴を持つ。これまでに本研究において，ペジレーション反応を利用した新生ペプチドの解析により，リボソーム出口トンネル内においてMTO1領域を含むCGS1新生ペプチドがAdoMetに応答して収縮したコンフォメーションを取ることを報告し，今年度は，数珠つなぎになって翻訳停止したリボソームの状態をピュロマイシン反応により明らかにした。今後の興味ある課題としては，Ser-94コドンでAdoMetに応答したCGS1 mRNAの翻訳停止に至る過程でのリボソームの状態変化を詳細にあきらかにすることである。次年度は，研究期間の最終年度であり，これまでに本研究で開発した手法，あるいは，CGS1 mRNAの翻訳の解析のために工夫してきた方法論を駆使して，AdoMetの検知から翻訳停止に至る素過程に迫る解析を行なう。
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Journal of Biological Chemistry
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