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2013 年度 実績報告書

シグナル制御複合体の構造と細胞内局在の電子顕微鏡解析

計画研究

研究領域細胞シグナリング複合体によるシグナル検知・伝達・応答の構造的基礎
研究課題/領域番号 22121004
研究機関独立行政法人産業技術総合研究所

研究代表者

佐藤 主税  独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 研究グループ長 (00357146)

研究期間 (年度) 2010-06-23 – 2015-03-31
キーワードシグナル伝達 / 分子複合体 / 電子顕微鏡 / タンパク質構造 / イオンチャネル
研究概要

TEMを用いた単粒子画像解析法は、精製された個々のタンパク質の電顕像から画像処理により3次元構造を計算する方法である。結晶を必要としないため、結晶作製が難しい複合体の構造解析に大きく貢献することが期待されている。元来は、比較的鮮明な画像が期待されるウィルスや巨大タンパク質を得意とする方法で、USAを中心として対称性の高いウィルス外殻で4Åを上回る分解能が達成された。近年では、数百kDaの比較的大きな4対称膜タンパク質で原子分解能が達成された。しかし、もっと小さな通常サイズの分子の解析が強く求められている。本手法は情報学とバイオの学際領域にあり、縦割社会の日本では研究者は少ない。分野を超えた研究展開が求められている。我々は、柔らかい情報処理を取り入れた新手法を開発してきている。さらに本年度は、新たな単粒子解析法の論文を出した。すなわち、確立概念に基づく新たなアルゴリズムによる粒子拾い上げ法と、work flowの最適化による自動化解析法を、Microscopy誌に2報の論文として報告した。
また、シグナル制御複合体を理解するには、細胞レベルでの研究も重要である。これら複合体は、一般に細胞内でダイナミックに会合・離散しながら機能を発揮するものが多い。光学顕微鏡観察は液中の細胞を観察できるが、光の波長は紫外線でも200nmであるので、この値を飛躍的に上回る分解能は期待できない。そのため、細胞を水溶液中で高分解能観察できる顕微鏡が求められていた。我々が開発したASEMは、解放環境にある溶液中の細胞が観察できる倒立型走査電顕である。細胞は固定するだけで水溶液中の自然な状態で観察できる。8nm分解能を有する。ASEMに正チャージ金によるラベル法を応用し、細胞の糖や細胞膜のラベルに有効であることを示した。さらに、細菌の鞭毛と線毛のラベルに成功した(Microscopy Research and Technique, 2014)。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本計画研究では、単粒子解析に関しては独自のアルゴリズム開発に成功して(microscopy,2013aと2013b)、SPPとMicrotubuleというシグナル伝達に重要な2つのタンパク質の詳細構造を解明することに成功した (JBC 2011, JCB 2012)。また、これまで難しかった1 micrometerを下回るタンパク質微結晶の詳細構造を、ASEMで液体中で観察・同定できるようになったのは、我々のグループの電子顕微鏡技術と千田グループの結晶化技術の融合研究による成果であるため。この手法は、全く新しい結晶スクリーニングの方向性と考える(IJMS 2012)。また、ASEMによる液中免疫電顕法の論文と(JSB 2012)、そこでの初代培養細胞の活用ができたため。

今後の研究の推進方策

単粒子解析法の精度を情報学的手法等を用いて向上させる。開発された方法を用いて、同領域内で連携して、シグナル伝達複合体を解析する。また、チューブリン、チャンネルの構造解析をさらに進め、タンパク質の分泌に重要なSecDFの構造変化を解明し、領域内外での共同研究を展開する。 ASEMに関しては、観察効率を上げるために、8枚窓ASEM dishを開発する。また、ASEMのサンプル側に関しては、細胞内の様々な構造を高コントラストで迅速に観察するために、 細胞内小器官を染め分けることを可能にする染色液を開発する。さらに、リガンドや抗体などによるASEMに効果的な標識ラベル法を開発する。ASEM法を改良してタンパク質結晶の高スループット観察を実現し、本領域の千田等とシグナル複合体の結晶化に向けての共同研究を展開する。

  • 研究成果

    (21件)

すべて 2014 2013 その他

すべて 雑誌論文 (11件) (うち査読あり 11件) 学会発表 (10件) (うち招待講演 4件)

  • [雑誌論文] TRPチャネルとOrai-STIM複合体系の構造と局在の解析2014

    • 著者名/発表者名
      三尾和弘, 丸山雄介, 小椋俊彦, 佐藤主税
    • 雑誌名

      実験医学

      巻: 32 ページ: 540~548

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 大気圧電子顕微鏡(ASEM)による抗体を選ばない水中免疫電顕法:細胞・タンパク質ミクロ結晶の液中観察2014

    • 著者名/発表者名
      海老原達彦, 西山英利, 佐藤真理, 千田俊哉, 須賀三雄, 佐藤主税
    • 雑誌名

      生化学

      巻: 86 ページ: 103~110

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Positively Charged Nanogold Label Allows the Observation of Fine Cell Filopodia and Flagella in Solution by Atmospheric Scanning Electron Microscopy2014

    • 著者名/発表者名
      H.Nishiyama, K.Teramoto, M.Suga, and C.Sato.
    • 雑誌名

      Microscopy Research and Technique

      巻: 77 ページ: 153~160

    • DOI

      10.1002/jemt.22322

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 正帯電金ナノ粒子標識法による鞭毛・線毛・細胞突起の大気圧走査電子顕微鏡観察2013

    • 著者名/発表者名
      西山英利、寺本華奈江、須賀三雄、佐藤主税
    • 雑誌名

      顕微鏡

      巻: 48 ページ: 190~194

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)による水中免疫電顕法:タンパク質複合体のダイナミックな離合集散と細胞内移動2013

    • 著者名/発表者名
      海老原達彦、村井稔幸、西山英利、佐藤真理、須賀三雄、佐藤主税
    • 雑誌名

      顕微鏡

      巻: 48 ページ: 107~112

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Electron-light Correlative Microscopy in Open Solution by Atmospheric Scanning Electron Microscope (ASEM)2013

    • 著者名/発表者名
      T.Ebihara, H.Nishiyama, M.Suga, C.Sato
    • 雑誌名

      Advances in Imaging and Electron Physics

      巻: 179 ページ: 152~154

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of hepatitis B virus core protein dimerized via a peptide linker containing an EGFP insertion2013

    • 著者名/発表者名
      M.Kikuchi, S.Iwabuchi, T.Kikkou, K.Noguchi, M.Odaka, M.Yohda, M.Kawata, C.Sato, O.Matsumoto
    • 雑誌名

      Acta Cryst

      巻: F69 ページ: 942~945

    • DOI

      10.1107/S1744309113019957

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 簡単・迅速前処理の大気圧走査電子顕微鏡JASM-62002013

    • 著者名/発表者名
      須賀三雄、西山英利、寺本華奈江、渡部善幸、佐藤主税
    • 雑誌名

      生物試料分析

      巻: 36 ページ: 235~244

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 大気圧電子顕微鏡(ASEM)による抗体を選ばない水中免疫電顕法 CRACチャネルの引き金となる、ER内Ca2+枯渇によるSTIM1凝集の可視化2013

    • 著者名/発表者名
      佐藤主税、西山英利、須賀三雄、佐藤真理、海老原達彦
    • 雑誌名

      日薬理誌

      巻: 141 ページ: 245~250

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Novel Convergence-Oriented Approach for Evaluation and Optimization of Workflow in Single Particle 2D Averaging of Electron Microscope Images,2013

    • 著者名/発表者名
      T.Moriya, K.Mio, C.Sato
    • 雑誌名

      Microscopy

      巻: 62 ページ: 491~513

    • DOI

      10.1093/jmicro/dft026

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Multi-reference-based multiple alignment statistics enables accurate protein particle pickup from noisy images2013

    • 著者名/発表者名
      M.Kawata, C.Sato
    • 雑誌名

      Microscopy

      巻: 62 ページ: 303~315

    • DOI

      10.1093/jmicro/dfs075

    • 査読あり
  • [学会発表] 大気圧電子顕微鏡ASEMによる水中の試料の観察法:迅速免疫電顕法

    • 著者名/発表者名
      海老原 達彦,西山 英利,須賀 三雄,佐藤 主税
    • 学会等名
      日本顕微鏡学会第69回学術講演会
    • 発表場所
      ホテル阪急エキスポパーク(大阪府吹田市千里万博公園1-5)
    • 招待講演
  • [学会発表] 大気圧走査電子顕微鏡

    • 著者名/発表者名
      佐藤主税,西山英利,海老原達彦,須賀三雄
    • 学会等名
      日本顕微鏡学会第69回学術講演会
    • 発表場所
      ホテル阪急エキスポパーク(大阪府吹田市千里万博公園1-5)
    • 招待講演
  • [学会発表] The atmospheric scanning electron microscope (ASEM) observes cells and tissues in open solution: Wet Immuno-EM

    • 著者名/発表者名
      T.Ebihara, H.Nishiyama, M.Suga, C.Sato
    • 学会等名
      日本組織培養学会 第86回大会
    • 発表場所
      産業技術総合研究所 つくばセンター (茨城県つくば市東1-1-1)
    • 招待講演
  • [学会発表] 透過型電子顕微鏡を用いた三次元再構成法によって明らかにされたTRPC5イオンチャネルの構造

    • 著者名/発表者名
      Memtily Nassirhadjy,三尾和弘,小椋俊彦,清中茂樹、森泰夫,佐藤主税
    • 学会等名
      第9回TRPチャネル研究会
    • 発表場所
      岡崎コンファレンスセンター(愛知県岡崎市明大寺町伝馬8-1)
  • [学会発表] 水中を観察できる新型電子顕微鏡ASEMを用いたマウスの研究:神経細胞初代培養やイオンチャンネルを中心として

    • 著者名/発表者名
      海老原 達彦,西山 英利,佐藤 真理,須賀 三雄,佐藤 主税
    • 学会等名
      第27回モロシヌス研究会
    • 発表場所
      理化学研究所バイオリソースセンター・森脇和郎ホール(茨城県つくば市)
  • [学会発表] 3D transmission electron microscopy of membrane proteins and direct observation of cells, tissues and crystals in solution using ASEM

    • 著者名/発表者名
      C.Sato, M.Kawata, H.Nishiyama, M.Suga, M.Sato,T.Senda, T.Ebihara, K.Mio
    • 学会等名
      ICSG2013-SLS
    • 発表場所
      京王プラザホテル札幌(札幌市中央区北5条西7-2-1)
  • [学会発表] The Atmospheric Scanning Electron Microscope (ASEM) Observes the Critical Moment of Platelet Generation from Megakaryocytes in Solution

    • 著者名/発表者名
      C.Sato, H.Nishiyama, Y.Maruyama, T.Ebihara, M.Suga, M.Yamamoto, H.Motohashi
    • 学会等名
      M&M2013
    • 発表場所
      Indiana Convention Center(Indianapolis, USA)
  • [学会発表] 水中が見れる大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)の臨床診断化にむけて

    • 著者名/発表者名
      佐藤主税
    • 学会等名
      第757回千葉県がんセンター研究所集談会
    • 発表場所
      千葉県がんセンター(千葉市中央区仁戸名町666-2)
    • 招待講演
  • [学会発表] 大気圧電子顕微鏡(ASEM)によるタンパク質微結晶と細胞内複合体の液中観察

    • 著者名/発表者名
      海老原 達彦,川田 正晃,西山英利,千田美紀,佐藤 真理,須賀三雄,千田俊哉,佐藤 主税
    • 学会等名
      第51回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      国立京都国際会館(京都市左京区宝ヶ池)
  • [学会発表] 大気圧走査電子顕微鏡による水中での細胞の観察:乳酸菌と細胞外構造

    • 著者名/発表者名
      杉本真也,奥田賢一,東山堅一,並木健西山英利,須賀三雄,松本俊介,園元謙二,水之江義充,佐藤 主税
    • 学会等名
      第36回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      神戸国際展示場(神戸市中央区港島中町6-11-1)

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公開日: 2015-05-28  

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