| 研究実績の概要 |
本申請で主なターゲットとするCAF-I複合体は、酵母からヒトまで進化上保存された複製依存のクロマチンアッセンブリー因子であり、p150, p60, p48という3種類のサブユニットから構成されるヘテロ三量体である。今年度は、出芽酵母CAF-I複合体を細胞内から高純度で精製することに成功した。精製の過程、特に濃縮のステップにおいて回収率が低かったため、様々な条件検討を行ったところ、回収率を向上させる条件を見出すことに成功した。その後、発見した条件で大量スケール（40L培養菌体）からの精製を行い、0.3mg/mL x 50uLの精製標品を得ることに成功した。電子顕微鏡にて負染色像観察を行ったところ、約10nmの均一な大きさの粒子が観察された。これらの粒子像から、試験的な単粒子解析像を得ることに成功した。
ヒトCAF-I複合体については、今年度までに昆虫細胞での大量発現系を構築することはできたが、大量精製においてはサブユニットの1つが非常に解離しやすいことが明らかになった。電子顕微鏡で約10nmの粒子を観察できたが、同時に小さなサイズの粒子も多数観察され、電子顕微鏡で観察された粒子像は不揃いになってしまっていた。サブユニットが解離する原因としては、a)複合体の形成に何らかの補助因子（分子シャペロンなど）が必要、b)サブユニットへの翻訳後修飾が必要、c)元来解離しやすいサブユニットである、などが考えられる。
ヒトHIRAについては、昨年度までに全長を単独で発現・精製することを試みたが極めて困難だったので、今年度は、相互作用因子との共発現や、一部ドメインの発現・結晶化を検討した。この中で、HIRAのC末端側ドメインについては結晶が得られており、現在、結晶の質を改善する試みを行っている。
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