ライブイメージングによる血管－神経ワイヤリングの誘導・維持機構の解明

2012 年度 実績報告書

• 研究領域: 血管ー神経ワイヤリングにおける相互依存性の成立機構
• 研究課題/領域番号: 22122003
• 研究機関: 独立行政法人国立循環器病研究センター
• 研究代表者: 望月 直樹 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (30311426)
• 研究分担者: 中嶋 洋行 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 研究員 (10467657)
• 研究期間 (年度): 2010-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 血管 / 神経 / イメージング / ワイヤリング / ゼブラフィッシュ / VEGF

研究実績の概要

形態形成時には、臓器への酸素供給と神経支配をそれぞれ制御するためのネットワークとして血管-神経が並行して構築される現象（伴走）が見出されている。この伴走の成立機構ならびに分子生物学的な相互作用のメカニズムの解明には至っていない。経と血管同時可視化を単一個体で行えるゼブラフィッシュを用いて伴走部位の同定と伴走成立機構を解明する。
大動脈とその直下に伴走する運動神経を見出した。大動脈はvascular endothelial growth factor-C (VEGF-C)を発現し運動神経がVEGFR-3を発現していることをそれぞれin situ hybridization, 定量的RT-PCRで確認した。したがってVEGF-C/VEGFR3シグナルが伴走のメカニズムと考え、運動神経のVEGF-Cへの反応性をex vivoで生体培養を行い確認したところ、ゼブラフィッシュ運動神経はVEGF-Cに反応してneuriteを多数伸ばすことが判った。さらにこの反応はVEGFR3の阻害薬で消失することから、ゼブラフィッシュの軸索伸張はVEGF-Cに反応して生じる可能性があることがわかった。
ゼブラフィッシュの成体内でVEGF-C/VEGFR3の情報伝達が機能しているか否かを判定するために動脈にVEGF-Cを過剰に発現する個体を作製して判定したところ、大動脈に向かう多数分枝した軸索を認めた。さらに、内因性のVEGF-Cをtrap可能なVEGFR-3（細胞外ドメイン）に免疫グロブリンFcフラグメント融合蛋白質を運動神経に発現させて、大動脈とその直下の運動神経を観察したところ、伴走が消失した。
以上の結果から大動脈―運動神経の伴走にVEGF-C/VEGFR3シグナルが重要であることを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

ゼブラフィッシュ生体での血管・神経形成時の血管-神経伴走部位の同定を行い、伴走機序を解明することを目的に本研究を開始した。まずは血管神経の同時可視化ゼブラフィッシュを作製することからはじめたが、順調に同時可視化できる個体を作製することができた。さらに、神経でも運動神経を特異的に可視化できる個体も作製した。伴走部位も今年度までに、多数みつけその中で大動脈とその直下の運動神経に着目して伴走の分子メカニズムを解明することができた。
他の伴走部位としてparachordal vesselと側線（神経）や、大動脈弓部にaa1-aa6に伴走する神経、脂肪組織内での細動脈と神経など複数の部位をみつけている。これらの部位では、大動脈―運動神経とは違った分子メカニズムによる相互作用があると考え、一つ一つ伴走メカニズムを解明する必要がある。
以上計画当初の計画であるイメージングによる伴走部位の同定とその分子メカニズムの解明というテーマは着実に達成していると考える。さらに、神経も様々な神経に特異的なプロモーターを用いることにより、神経のイメージングだけでもそれぞれの神経を分離できる技術の確立まで達成している。さらに、血管系についても動脈のみ、静脈のみ、リンパ管のみをそれぞれ可視化できる個体を樹立しているので、われわれ自身の達成度は当初計画よりもさらに進んだペースで研究が進んでいると自負している。
今年度は追加配分により、さらにイメージングシステムが充実したのも、本研究の推進を後押ししてくれたものと感謝している。

今後の研究の推進方策

ゼブラフィッシュ生体での血管・神経形成時の血管-神経伴走部位の同定には、どの神経（運動神経、感覚神経、交感神経、副交感神経）とどの血管（動脈、静脈、リンパ管）が伴走するかを正確に捉える必要がある。このために、まず交感神経特異的に緑色蛍光蛋白質を発現する系を確立することを優先することにした。交感神経系の可視化にはさらに工夫をしてtyroxin hydroxylaseのプロモーターでGal4/VP16を発現させ、レポーターフィッシュとして14xUAS:EGFPを用いてこれを交配することにより、より蛍光発現の強い交感神経可視化フィッシュを作製することにした。
伴走メカニズムは、ケモカイン、増殖因子など様々な分子がそれぞれ異なる部位で機能を発揮していると予想できる。血管、神経のどちらかが先に形成されるか？同時に形成されるか？によって誘導因子の産生部位も受容部位も異なるであろうから、伴走部位を一つ一つ丁寧に調べていくしか、手はないと考えている。
このために、まずは交感神経分布が密である、脂肪組織と心臓に着目して交感神経とどの血管が伴走するかをまず確認しながら、血管・神経・脂肪（あるいは心筋）に発現する伴走誘導因子の候補を探索していく計画である。現在まで順調に計画を達成できていると考えているので研究推進体制を維持さらには、このテーマに関わる研究者の数を増やしてさらなる研究の推進を図る（実際に流動研究員と大学院生を増員してこのテーマ遂行に努力している）。

研究成果

• [雑誌論文] Involvement of EphA2-mediated tyrosine phosphorylation of Shp2 in Shp2-regulated activation of (2013)
  • 著者名/発表者名: Miura K, Wakayama Y, Tanino M, Orba Y, Sawa H, Hatakeyama M, Tanaka S, Sabe H, and Mochizuki N
  • 雑誌名: Oncogene 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1038/onc.2012.571.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The sphingosine-1-phosphate transporter Spns2 expressed on endothelial cells regulates lymphocyte trafficking in mice. (2012)
  • 著者名/発表者名: Fukuhara S, Simmons S, Kawamura S, Inoue A,Tokudome T, Sunden Y, Arai Y, Moriwaki K, Ishida J, Uemura A, Kiyonari H, Abe T, Fukamizu A, Hirashima M, Sawa H, Aoki J, Ishii M, Mochizuki N
  • 雑誌名: J. Clin. Invest. 巻: 122 ページ: 1416-1426
  • 査読あり
• [学会発表] イメージングによる心臓・血管発生メカニズムの解明 (2013)
  • 著者名/発表者名: 望月直樹
  • 学会等名: 第９０回日本生理学会大会
  • 発表場所: タワーホール船堀、東京
  • 年月日: 2013-03-27 – 2013-03-29
  • 招待講演
• [学会発表] in vivo imaging of signal transduction pathways involved in angiogenesis (2012)
  • 著者名/発表者名: Shigetomo Fukuhara (Naoki Mochizuki)
  • 学会等名: The 20th annual meeting of the Japanese vascular biology and medicine organization
  • 発表場所: Awagin hall, Tokushima
  • 年月日: 2012-12-05 – 2012-12-07
  • 招待講演
• [備考] 独立行政法人国立循環器病研究センタ―研究所細胞生物学部
  • URL: http://plaza.umin.ac.jp/ncvc/