ビーズテクノロジーによる標的探索と生物学的評価

2014 年度 実績報告書

• 研究領域: 天然物ケミカルバイオロジー：分子標的と活性制御
• 研究課題/領域番号: 23102002
• 研究機関: 東京医科大学
• 研究代表者: 半田 宏 東京医科大学, 医学部, 教授 (80107432)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 天然物リガンド / 分散性磁性ビーズ / 固定化 / アフィニティ精製 / 標的タンパク質 / 質量分析 / 生体内作用機構

研究実績の概要

研究代表者らは、分散性ポリマー磁性ビーズ（半田ビーズ）を利用するアフィニティ精製によって、薬剤などの生物活性物質の標的タンパク質を単離し、質量分析によって同定する技術を構築してきた。本研究課題では、特異な生物活性を持つ天然物リガンドの標的タンパク質の単離・同定を半田ビーズの活用によって達成し、天然物リガンドが示す生物活性の生体内作用機構、及び天然物リガンド標的タンパク質が関与する生体反応のシグナルネットワークの解明を目指している。
天然物の化学構造や活性を基盤に、これまでに多種多様な生物活性物質が産み出されている。オキサゾールやチアゾールといったヘテロ環は生物活性天然物においてしばしば見られる部分構造である。加えて、フッ素が導入された化合物は薬理作用を改善させる機能を持つことが知られている。今回、アポトーシス活性を指標に、天然物を模倣したベンゼン環を置換基に持つフッ素化チアゾール群の抗がん活性を評価したところ、広範囲のがん細胞に対し、p53の状態に関係なく、数μＭで細胞増殖阻害を示すフッ素化チアゾールが存在することがわかった。当該フッ素化チアゾールの標的タンパク質をアフィニティ精製によって単離・同定するべく、構造活性相関研究を経て、フッ素化チアゾール固定化半田ビーズを作製した。がん細胞から調整した粗抽出液と半田ビーズを混合し、洗浄工程を経て、フッ素化チアゾールに結合するタンパク質群を得た。競合阻害実験により、フッ素化チアゾールに特異的に結合するタンパク質（２種）を決定し、質量分析によって同定したところ、プロヒビチン1,2であった。プロヒビチンはアポトーシスに関わる因子であることから、フッ素化チアゾールはプロヒビチンと結合し、p53とは無関係に抗がん活性を示すと考えられる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまで展開してきた薬剤固定化半田ビーズの作製方法を、多様な官能基を有する天然物リガンドに適用し、様々な天然物リガンド固定化半田ビーズを作製してきた。天然物リガンド固定化半田ビーズを用いた標的タンパク質のアフィニティ精製では、不活性体を用いた対照実験や過剰量のリガンドを用いた競合阻害実験などにより、天然物リガンドに特異的に結合するタンパク質（群）を単離し、質量分析によって同定してきた。
本研究期間にて、ビタミンK2やサリチル酸、ステロイドといった天然物リガンドのみならず、ビスフェノールやベスナリノン、フッ素化チアゾールなど、特異な生物活性を示す合成化合物の特異的結合タンパク質を単離・同定してきた。リガンドを利用した結合タンパク質の生化学的解析などを通じ、天然物リガンドを含む様々な生物活性物質の標的タンパク質を決定し、生物活性物質の生体内作用機構の一端を解明してきた。

今後の研究の推進方策

天然物リガンドが示す化学構造の多様性に応じて、半田ビーズ上に天然物リガンドを効率的、かつ確実に固定化できる手法の確立を引き続き検討する。標的タンパク質のアフィニティ精製に用いるタンパク質ライブラリ（粗抽出液）は、天然物リガンドに応答する培養細胞や組織から適切な条件（界面活性剤の利用など）を用いて調整する。天然物リガンドに結合するタンパク質（群）のアフィニティ精製では、これまでと同様、天然物リガンドの不活性体を用いた対照実験や過剰量の天然物リガンドを利用した溶出実験、競合阻害実験などを通じて得られた結果を総合的に判断し、天然物リガンドに特異的に結合するタンパク質（群）を決定する。質量分析によってこれらタンパク質（群）を同定し、天然物リガンドを活用したタンパク質の生化学的解析などにより、天然物リガンドの標的タンパク質を同定し、天然物リガンドが示す生物活性の詳細を分子レベルで解明する。

研究成果

• [雑誌論文] SV40 VP1 major capsid protein in its self-assembled form allows VP1 pentamers to coat various types of artificial beads in vitro regardless of their sizes and shapes (2015)
  • 著者名/発表者名: M.-A. Kawano, K. Doi, H. Fukuda, Y. Kita, K. Imai, T. Inoue, T. Enomoto, M. Matsui, M. Hatakeyama, Y. Yamaguchi, H. Handa
  • 雑誌名: Biotechnol. Rep. 巻: 5 ページ: 105-111
  • DOI: 10.1016/j.btre.2014.12.008
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the human cereblon-DDB1- lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs (2014)
  • 著者名/発表者名: P. Chamberlain, A. Lopez-Girona, K. Miller, G. Carmel, B. Pagarigan, B. Chie-Leon, E. Rychak, L. Corral, Y. Ren, M. Wang, M. Riley, S. Delker, T. Ito, H. Ando, T. Mori, Y. Hirano, H. Handa, T. Hakoshima, T. Daniel, B. Cathers
  • 雑誌名: Nat. Struct. Mol. Biol. 巻: 21 ページ: 803-809
  • DOI: 10.1038/nsmb.2874
  • 査読あり
• [雑誌論文] A trifluorinated thiazoline scaffold leading to pro-apoptotic agents targeting prohibitins (2014)
  • 著者名/発表者名: A. Perez-Perarnau, S. Preciado, C. M. Palmeri, C. Moncunill-Massaguer, D. Iglesias-Serret, D. M. Gonzalez-Girones, M. Miguel, S. Karasawa, S. Sakamoto, A. M. Cosialls, C. Rubio-Patino, J. Saura-Esteller, R. Ramón, L. Caja, I. Fabregat, G. Pons, H. Handa, F. Albericio, J. Gil, R. Lavilla
  • 雑誌名: Angew. Chem. Int. Ed. 巻: 53 ページ: 10150-10154
  • DOI: 10.1002/anie.201405758
  • 査読あり
• [雑誌論文] DSIF and NELF interact with Integrator to specify the correct post-transcriptional fate of snRNA genes (2014)
  • 著者名/発表者名: J. Yamamoto, Y. Hagiwara, K. Chiba, T. Isobe, T. Narita, H. Handa, Y. Yamaguchi
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 5 ページ: 4263
  • DOI: 10.1038/ncomms5263
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Inhibition of protein SUMOylation by davidiin, an ellagitannin from Davidia involucrata (2014)
  • 著者名/発表者名: M. Takemoto, Y. Kawamura, M. Hirohama, Y. Yamaguchi, H. Handa, H. Saitoh, Y. Nakao, M. Kawada, K. Khalid, H. Koshino, K. Kimura, A. Ito, M. Yoshida
  • 雑誌名: J. Antibiot. (Tokyo) 巻: 67 ページ: 335-338
  • DOI: 10.1038/ja.2013.142
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] アフィニティビーズを利用した生物活性物質標的タンパク質の単離・同定・評価 (2015)
  • 著者名/発表者名: 坂本 聡、山口雄輝、半田 宏
  • 学会等名: 日本薬学会第135年会
  • 発表場所: 神戸学院大学
  • 年月日: 2015-03-25 – 2015-03-28
  • 招待講演
• [学会発表] セレブロン －IMiDs標的分子研究の最前線－ (2015)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏
  • 学会等名: セルジーン講演会
  • 発表場所: ヨコハマ グランド インターコンチネンタルホテル
  • 年月日: 2015-02-28 – 2015-02-28
  • 招待講演
• [学会発表] ケミカルで知り、ケミカルで動かす －サリドマイド催奇性のターゲットの発見から創薬への展開－ (2015)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏
  • 学会等名: サントリー生命科学財団セミナー
  • 発表場所: サントリー生命科学財団
  • 年月日: 2015-02-04 – 2015-02-04
  • 招待講演
• [学会発表] サリドマイド催奇性のターゲットの発見から創薬への展開 －ケミカルで知り、ケミカルで動かす－ (2015)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏
  • 学会等名: 埼玉医科大学 ゲノム医学研究センターセミナー
  • 発表場所: 埼玉医科大学
  • 年月日: 2015-01-23 – 2015-01-23
  • 招待講演
• [学会発表] E3ユビキチンリガーゼの基質認識レセプターCRBNとポマリドマイド依存的な基質Aiolosの生化学的解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 片山美樹、伊藤拓水、安藤秀樹、山口雄輝、半田 宏
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] IMiDsの多彩な薬理作用 ～標的分子探索研究の進歩～ (2014)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏
  • 学会等名: 第76回日本血液学会学術集会
  • 発表場所: 大阪国際会議場
  • 年月日: 2014-10-31 – 2014-11-01
  • 招待講演
• [学会発表] Screening and Evaluation of Natural Product Targets (2014)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏、坂本 聡
  • 学会等名: 新学術領域研究「天然物ケミカルバイオロジー ～分子標的と活性制御～」第３回国際シンポジウム
  • 発表場所: 千里ライフサイエンスセンター
  • 年月日: 2014-10-28 – 2014-10-29
• [学会発表] ケミカルで生命の謎を知る！ (2014)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏
  • 学会等名: 東京医科大学 第48回医科学フォーラム
  • 発表場所: 東京医科大学 教育研究棟
  • 年月日: 2014-09-24 – 2014-09-24
  • 招待講演
• [学会発表] セレブロン ～サリドマイド催奇性から創薬への展開～ (2014)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏
  • 学会等名: セルジーン血液腫瘍フォーラム
  • 発表場所: 京都国際ホテル
  • 年月日: 2014-09-13 – 2014-09-13
  • 招待講演
• [学会発表] 大学のシーズ研究から実用化に向けて －大学における基礎研究の重要性－ (2014)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏
  • 学会等名: 信州大学 医学部 メディカル・ヘルスイノベーション講座 第8回定例講演会
  • 発表場所: 信州地域技術メディカル展開センター
  • 年月日: 2014-09-09 – 2014-09-09
  • 招待講演
• [学会発表] IMiDsのセレブロンを介した多様な薬理作用 (2014)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏
  • 学会等名: Shinjuku Myeloma Conference
  • 発表場所: 国際医療研究センター
  • 年月日: 2014-07-24 – 2014-07-24
  • 招待講演
• [学会発表] Idenification of a primary target of thalidomide teratogenecity: towards the debelopment of new drugs. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Handa
  • 学会等名: RNA Biology
  • 発表場所: McGovern Institute,MIT Bldg. USA
  • 年月日: 2014-06-14
• [学会発表] 抗炎症薬サリチル酸の生体内作用機構の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 坂本 聡、Vipul Gupta、劉 舒捷、安藤秀樹、舘野峻平、金子裕生、湯上真人、石井亮平、濡木 理、山口雄輝、半田 宏
  • 学会等名: 第９回日本ケミカルバイオロジー学会
  • 発表場所: 大阪大学会館
  • 年月日: 2014-06-11 – 2014-06-13
• [学会発表] 分子標的探索と生物学的評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏、坂本 聡
  • 学会等名: 新学術領域研究「天然物ケミカルバイオロジー ～分子標的と活性制御～」第６回公開シンポジウム
  • 発表場所: 名古屋大学 坂田・平田ホール
  • 年月日: 2014-05-28 – 2014-05-29
• [学会発表] IMiDsの作用機序 －近年の報告から－ (2014)
  • 著者名/発表者名: 半田 宏
  • 学会等名: Therapeutic strategies for Multiple Myeloma 2014
  • 発表場所: ホテル日航福岡
  • 年月日: 2014-04-12 – 2014-04-12
  • 招待講演
• [図書] Organ Biology NO.21 Vol.2 (2015)
  • 著者名/発表者名: 伊藤拓水、安藤秀樹、半田宏
  • 総ページ数: 273(134-140)
  • 出版者: (株)日本医学館
• [図書] IMiDs基礎と臨床2015 (2015)
  • 著者名/発表者名: 伊藤拓水、安藤秀樹、半田宏
  • 総ページ数: 233(26-34)
  • 出版者: (株)メディカルレビュー社
• [図書] 生物活性分子のケミカルバイオロジー:標的同定と作用機構- CSJカレントレビュー第19号（日本化学会編） (2015)
  • 著者名/発表者名: 坂本 聡、伊藤拓水、半田 宏
  • 総ページ数: 189(86-93)
  • 出版者: 化学同人
• [図書] 日本臨牀（特集：多発性骨髄腫の病態と最新治療－基礎と臨床の最新情報－） (2015)
  • 著者名/発表者名: 伊藤拓水、安藤秀樹、半田 宏
  • 総ページ数: 182(143-148)
  • 出版者: 日本臨牀社
• [図書] 多摩川技報 (2014)
  • 著者名/発表者名: 寺田孝太郎、田中俊行、羽生尚広、本田孝行、半田 宏
  • 総ページ数: 57(13-18)
  • 出版者: 多摩川精機株式会社
• [図書] 実験医学増刊「驚愕の代謝システム」 (2014)
  • 著者名/発表者名: 加部泰明、末松 誠、半田 宏
  • 総ページ数: 206(142-149)
  • 出版者: 羊土社
• [図書] マイクロ／ナノカプセルの調製、徐放性制御と応用事例 (2014)
  • 著者名/発表者名: 坂本 聡、半田 宏
  • 総ページ数: 510(250-256,277-284)
  • 出版者: 株式会社技術情報協会