| 研究領域 | 統合的神経機能の制御を標的とした糖鎖の作動原理解明 |
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| 研究課題/領域番号 |
23110002
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
門松 健治 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80204519)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 糖鎖 / 神経 / プロテオグリカン |
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| 研究実績の概要 |
これまでに、眼優位性可塑性において、特に幼弱期（感受性期）においてKS欠損マウスで非遮蔽眼（同側）の反応性増大が起きないことを見出した。その本態となるLTPがT型カルシウムチャンネル依存性のものであることを明らかにした。さらに、この眼優位性可塑性の変化に関与するKSは低硫酸化KSであることが分かった。本年度、さらに低硫酸化KSはKS/CSプロテオグリカンであるフォスファカン上にあることを見出した。電子顕微鏡による解析により、低硫酸化KSは特にシナプス周囲、シナプス後部に分布することが分かった。以上から、低硫酸化KSが片眼遮蔽後の非遮蔽眼の反応とLTPの発動に必須であることが明らかになった。
また、これまで、軸索再生の阻害の責任分子としてフォスファカンを同定した。活性化したアストログリアからフォスファカンが産生され、精製したフォスファカンは軸索伸長阻害活性を示した。フォスファカンの濃度勾配を持たせたコーティングを施した基質上で後根神経節神経の軸索は、損傷軸索の特徴であるdystrophic endballをKS, CS依存的に形成した。さらにdystrophic endballの内部ではオートファジーが盛んに起こることを明らかにした。そして、CS受容体であるPTPsigmaがフォスファカンと結合することも判明した。以上から、フォスファカン→PTPsigma→オートファジー→dystrophic endballという作用機構の仮説を想定することが可能となった。本年度はさらに、オートファジー誘導がdystrophic endball形成の原因となることをSNAREタンパク質のノックダウンなどを通して証明した。加えてへパラン硫酸（HS）とCSの軸索伸長に対する差別化の分子機構の一部を明らかにすることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、感受性期特異的に、しかも非遮蔽眼（同側）特異的な眼優位性可塑性の異常に関与するKSは低硫酸化KSであることが分かった。本年度、さらに低硫酸化KSはKS/CSプロテオグリカンであるフォスファカン上にあることを見出した。電子顕微鏡による解析により、低硫酸化KSは特にシナプス周囲、シナプス後部に分布することが分かった。以上から、低硫酸化KSが片眼遮蔽後の非遮蔽眼の反応とLTPの発動に必須であることが明らかになった。
また、活性化したアストログリアからフォスファカンが産生され、精製したフォスファカンは軸索伸長阻害活性を示した。フォスファカンの濃度勾配を持たせたコーティングを施した基質上で後根神経節神経の軸索は、損傷軸索の特徴であるdystrophic endballをKS, CS依存的に形成した。さらにdystrophic endballの内部ではオートファジーが盛んに起こることを明らかにした。そして、CS受容体であるPTPsigmaがフォスファカンと結合することも判明した。以上から、フォスファカン→PTPsigma→オートファジー→dystrophic endballという作用機構の仮説を想定することが可能となった。本年度はオートファジー誘導がdystrophic endball形成の原因となることをSNAREタンパク質のノックダウンなどを通して証明した。
加えてへパラン硫酸（HS）とCSの軸索伸長に対する差別化の分子機構の一部を明らかにすることができた。すなわち、HSは軸索伸長を促進し、CSは阻害することが知られている。この同じ硫酸化糖鎖が正反対の作用を示すことの本態は、（1）糖鎖機能ドメインの長さと硫酸化パターン（これらは特異な硫酸化糖鎖の出現確率に依存する）（2）受容体複合体の変化の2つで説明できることが分かった。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．軸索再生・分枝阻害に関わるCSPGの作用機構：後根神経節細胞をCSPGの濃度勾配のある基質上に初代培養し、dystrophic endballを形成させる。dystrophic endball内にできるオートファゴゾームについて、受容体型PTPの基質となる分子群の動態を、免疫染色、ウェスタンブロット、RNAi、レスキューなどの手法を用いて調べる。さらにオートファジーに必要なsnareタンパク質のノックダウンやリン酸化解析などを通して、オートファゴゾームの前後、どの時期にPTP sigmaからのシグナルが入るのかを検討する。
２．軸索再生促進に関わるヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）の作用機構：HSPGの受容体もPTP sigmaである。一方、HSPGは軸索伸長を促すが、CSPGはそれを阻害する。この正反対の現象は如何にして起こるのか。上記１．で示した現象をHSPGについて洗い直し、HSPGによる軸索伸長促進についての細胞内シグナルを明らかにする。
３．糖鎖機能ドメインの解析：上述したCSPGとHSPGの差異を最もよく説明するモデルは、CSおよびHSそれぞれの糖鎖機能ドメインの違いによる受容体のダイマーあるいはモノマー形成にある。化学合成によってCSおよびHSの様々な候補オリゴ糖を作成し、PTP sigmaへの結合、ダイマーあるいはモノマー形成、およびdystrophic endball形成を指標に糖鎖機能ドメインを同定する。さらに糖鎖機能ドメインの機能をin vitro（dysptrophic endball形成）とin vivo（脊髄損傷）の両方のモデルを用いて検証する。
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