計画研究
ガングリオシド糖鎖と相互作用する分子の同定をさらに幅広く実施して、その分子群の固有の機能と共に、作用機構を生化学的解析とイメージングにより検討した。前年度の成果をふまえ、通常の共焦点顕微鏡による糖脂質糖鎖との共局在や膜上動態を明らかにすると共に、詳細な動態イメージング解析の基本条件を明らかにした。1. 新生児マウス脳からの初代培養グリア細胞膜上で、ガングリオシド近傍の分子を、enzyme-mediated activation of radical sources (EMARS) 反応と質量分析(MS) により同定した。培養アストロサイトでは、GD3を標的にしたEMARSにより、PDGF受容体αを同定し、免疫沈降実験でGD3との特異的結合を明らかにした。さらにPDGFRαがGD3との結合に基づいてより強い浸潤能を獲得することを示した。2. 細胞膜脂質ラフトにおけるガングリオシドと神経伝達物質受容体の機能的関連の解明のために、シナプス伝達に重要なAMPA受容体に対するガングリオシド欠損の影響を糖鎖欠損マウスにより検討した。海馬切片を用いた長期増強（long-term potentiation、LTP）の検討の結果、GM2/GD2合成酵素ノックアウトの海馬切片では著明なLTP低下が認められた。一方、GD3合成酵素ノックアウトマウスでは、明らかな表現型異常が認められないにもかかわらず明瞭なLTPの低下が見られた。（宮崎大学 高宮博士との共同研究）3. 糖脂質糖鎖の膜ミクロドメイン局在の動態を、１分子イメージングにより検討した。そのために、蛍光標識GM1と各種ガングリオシド特異発現細胞株を用いて、ガングリオシド２量体形成の解析を行ない、同一糖脂質同士の２量体形成をミリ秒レベルで証明した。さらにガングリオシドGM3, GD3の糖鎖蛍光標識により、超分解能イメージング解析を実施中である。
2: おおむね順調に進展している
２４年度内にグリアの培養系を確立して、種々の応用実験を実施する予定であったが、資材の入手難等により達成できなかったので、２５年に繰り越して実施した。その結果、再現性よくマウス新生児脳からのグリア（アストロサイト、ミクログリア）などの初代細胞培養が可能となり、また大量培養についても容易に実施可能となった。よって、これを用いたEMARS法と質量分析法の融合によるガングリオシド近傍分子の同定や、グリアによるサイトカイン分泌能、刺激に対する反応等の検討が順調に進展した。
1. ガングリオシド糖鎖と結合する分子の同定を、いくつかの細胞系と糖鎖抗原を用いてさらに展開して、同定された分子の機能解析と作用機構を、生化学的解析とイメージング解析を融合して明らかにする。 2. 新生児マウス脳からの初代培養アストロサイトのガングリオシドGD3、GD2近傍分子を、enzyme-mediated activation of radical sources (EMARS) 反応と質量分析(MS) により同定する。 3. GD3とPDGFRαの相互作用に基づく増強シグナルの分子機構を、Srcファミリーキナーゼ、アダプター分子、接着関連分子等を含めて検討する。 4. 同様にヒトグリオーマを用いて、ガングリオシドGD3を標的にしたEMARS反応を行ない、GD3近傍分子を同定する。同定される分子の中で興味ある分子に焦点化してその機能解析およびガングリオシドとの相互作用を検討する。 5. 培養マウスアストロサイト、マウスのin vivo グリオーマ組織等を用いて、GD3、PDGFRαなどの局在について検討し、共局在を明らかにする。とくにGD3および同定分子群の細胞先端部位（lamellipodia）への集積につき検討する。 6. ガングリオシドの神経可塑性における機能解析を行う。前年に引き続いて、種々のガングリオシド欠損マウス由来の脳組織を用いて、長期増強(Long term potentiation, LTP)を測定する。とくに異常表現型に乏しいGD3合成酵素ノックアウトマウスの海馬スライスを用いてLTPを測定し（宮崎大学 高宮博士との共同研究）、b-系列ガングリオシドの機能を解明する。 7.ガングリオシドとタンパク質との相互作用の１分子イメージングを行なう。また、GD3等の蛍光標識ガングリオシドが新たにできたので、超分解能イメージングによる２量体形成の動態解析を行う。
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