計画研究
ラット腸管上皮細胞IEC6細胞は増殖因子シグナルの非存在下では、シスト状の構造をとるが、Wnt3aとEGFとの共刺激（Wnt3a/EGF）により管状構造を形成した。Wnt3a/EGFシグナルの活性化により発現する遺伝子としてArl4cとP2Y2Rを見出し、Arl4cに関して昨年度報告した。P2Y2RをsiRNAによりノックダウンすると、Wnt3a/EGF依存性の管腔構造形成は阻害され、P2Y2Rを発現することにより、siRNAの表現型はレスキューされた。P2Y2Rは、7回膜貫通型のG蛋白質共役型受容体であり、ATP受容体として機能することが知られていたので、Wnt3a/EGFとともにATPでIEC6細胞を刺激したが、管腔形成には影響しなかった。ATPに結合できないP2Y2R変異体は、野生型P2Y2Rと同様にP2Y2Rのノックダウンによる管腔構造形成阻害をレスキューした。したがって、P2Y2RはATPのシグナル伝達以外の機能を介して、Wnt3a/EGF依存性の上皮管腔形成を制御する可能性が示唆された。Wnt3a/EGF依存的な管腔形成に伴ってIEC6細胞は脱極性化するとともに、細胞形態が伸長した。また、伸長化したIEC6細胞では、部分的に接着斑の形成が抑制された。P2Y2Rは細胞外領域にインテグリン結合配列 (RGD) を有している。インテグリンと結合しないP2Y2R変異体は、P2Y2Rのノックダウンによる管腔構造形成阻害をレスキューできなかった。フィブロネクチンはIEC6細胞から分泌され、インテグリンと結合するが、RGD様ペプチドによりフィブロネクチンとインテグリンの結合を阻害すると、管腔構造形成が促進された。したがって、Wnt3a/EGF刺激によるP2Y2Rの発現は細胞―細胞外基質間接着を適切に阻害することにより、上皮管腔組織形成を促進することが明らかになった。
2: おおむね順調に進展している
昨年度は、本新学術領域の研究成果として開発したラット腸管上皮細胞IEC6細胞を三次元培養（マトリゲル存在）する実験系を用いて、Wnt3aとEGFの共刺激により管状の構造を形成する分子機構として、低分子量Gタンパク質Arl4cが発現することの重要性を明らかにした。本年度はヌクレオチド受容体P2Y2Rが発現することの意義について解析した。P2Y2Rは7回膜貫通型のG蛋白質共役型受容体で、細胞外ATPをリガンドとして活性化するとともに、インテグリンに結合することが知られていた。P2Y2Rの発現はインテグリンとフィブロネクチンの結合を適切に阻害することにより、ATP非依存性に上皮管腔組織形成を促進した。したがって、上皮管腔構造形成における細胞―細胞外基質接着の重要性が明らかになった。本研究計画が目指している「分岐」、「伸長」をキーワードにした上皮管腔形成の分子機構の解明のために、Arl4cに加えてP2Y2Rという新規の重要な分子を見出すことができたと考えている。さらに、唾液腺、肺、腎臓の原基から間質を除去して上皮のみにして、マトリゲル存在下で液性因子を組み合わせることにより、唾液腺導管、肺細気管支、尿管の管腔形成を解析するin vitro培養系を確立できた。これら3種の異なる上皮管腔組織形成にArl4cやP2Y2Rが関与するかを明らかにすることが可能であり、培養細胞系を用いて得た知見が、生体組織においても適合するかを確認できる体制となっている。
今後はP2Y2R発現による細胞―細胞外基質間接着の阻害が、どのようにしてWnt3a/EGF依存性のIEC6細胞管腔構造形成に関与するかを明らかにする。また、マウス胎児から摘出した唾液腺や肺等の器官培養系においてもP2Y2Rが重要であるか否かを解析していく予定である。P2Y2RはWntシグナルとEGFシグナルの標的分子として見出された。両シグナル経路の異常活性化が多くのヒト癌症例で見出されている。昨年度報告したArl4cはヒト大腸癌と肺癌症例の50％以上で過剰発現していることを既に見出している。また、Arl4cのノックダウンが大腸癌細胞株、肺癌細胞株の腫瘍増殖能を阻害したので、Arl4cを分子標的とする核酸医薬開発の研究にも着手をしている。今後は癌の発症におけるP2Y2Rの役割も明らかにする予定である。これらの実験は、上皮管腔組織の「形成・維持」と「破綻」の両面からアプローチしている本領域においては、重要な研究となる。
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