複製フォークの安定化機構とその破綻による病態の解析

2011 年度 実績報告書

• 研究領域: ゲノムを支える非コードＤＮＡ領域の機能
• 研究課題/領域番号: 23114010
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 高田 穣 京都大学, 放射線生物研究センター, 教授 (30281728)
• キーワード: DNA複製フォーク / 染色体ストレス / チェックポイント / 染色体脆弱部位 / クロマチン / ファンコニ貧血 / ATRIP-ATR

研究概要

1)染色体ストレス高感受性部位の網羅的解析:染色体ストレス高感受性部位を同定し、その性状を解析するため、まずATRIP、FANCD2に対する抗体を作成中である。両者のGST融合蛋白質を大腸菌から精製し、ウサギ二匹づつに免疫を行っている。また、GFPやFLAG-HAタグを付加したATRIP、FANCD2等のDNA損傷応答タンパク質を発現するヒト細胞株を入手、作成した。最低限これらの細胞を使用して検討は可能であるが、さらに、タグ配列を内在性遺伝子座にノックインした細胞を作成するのが望ましいと考え、最近注目のゲノム編集法であるTALENの導入を開始した。一方、ニワトリDT40細胞におけるfragile siteの同定のため、ヒト細胞と同様のプロトコールで染色体断裂の誘導を試みたが、不調に終わった。さらに、ヒト3番染色体をもつDT40を鳥取大学押村教授より入手し、同様に調べたが、染色体断裂は観察できなかった。ニワトリ細胞でもヒトなどのfragileサイトに相当する遺伝子は保存されているが、その性質は異なっていると考えられ、ニワトリにおける染色体断裂としてのfragile siteの検討は不可能であると判断した。
2)複合体プロテオミクスによる複製フォーク安定化と崩壊機構の解析:Hela S3細胞に、ATRIP、FANCD2、FANCI、FANCLなどをFLAG-HAタグを付加してレトロウイルスで発現させた。これらの因子の複合体精製を行い、新規の会合因子を複数同定することに成功した。染色体ストレス下のATRのリン酸化基質の網羅的同定を目指し、Silac法の検討を開始した。
3)染色体ストレス下のチェックポイントキナーゼATRIP-ATR初期活性化機構の解析:染色体ストレスの初期応答においては、中心分子であるATRがクロマチンに集積し、さらに様々な因子依存的にATRが活性化される。しかし、その分子機構はいまだに十分理解されていない。我々は、ATRの必須会合分子であるATRIP分子がクロマチンに集積するために、ファンコニ貧血コア複合体成分が重要であることを見出した。この成果を論文投稿中である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ChIP法による検討を行うための細胞と抗体の準備は遅れているが、その他の研究項目については、順調に複合体の精製、成分の同定などが進んでいる。

今後の研究の推進方策

遺伝子の自由な改変が可能なことがニワトリDT40細胞の最大の利点であり、fragile siteの検討をDT40細胞で行う予定であったが、少なくとも顕微鏡下で染色体断裂を観察する方法では不可能と思われる。今後は、ヒト細胞に系をうつし、新規ゲノム編集技術TALENを導入することで、DT40と同様の利点をヒト細胞の検討において実現できるよう検討していく。

研究成果

• [雑誌論文] Formaldehyde catabolism is essential in cells deficient for the Fanconi anemia DNA-repair pathway (2012)
  • 著者名/発表者名: Rosado IV, Langevin F, Crossan GP, Takata M, Patel KJ
  • 雑誌名: Nat Struct Mol Biol 巻: 18 ページ: 1432-4
  • DOI: 10.1038/nsmb.2173
  • 査読あり
• [雑誌論文] ATR-Chk1 signaling pathway and homologous recombinational repair protect cells from 5-fluorouracil cytotoxicity (2012)
  • 著者名/発表者名: Fujinaka Y, Matsuoka K, Iimori M, Tuul M, Sakasai R, Yoshinaga K, Saeki H, Morita M, Kakeji Y, Gillespie DA, Yamamoto KI, Takata M, Kitao H, Maehara Y
  • 雑誌名: DNA Repair (Amst) 巻: 11 ページ: 247-58
  • DOI: 10.1016/j.dnarep.2011.11.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] ATR-ATRIP kinase complex triggers activation of the Fanconi anemia DNA repair pathway (2012)
  • 著者名/発表者名: Shigechi T, Tomida J, Sato K, Kobayashi M, Eykelenboom JK, Pessina F, Zhang Y, Uchida E, Ishiai M, Lowndes NF, Yamamoto K, Kurumizaka H, Maehara Y, Takata M
  • 雑誌名: Cancer Res 巻: 72 ページ: 1149-1156
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-11-2904
  • 査読あり
• [雑誌論文] A robustly stimulates FANCD2 monoubiquitylation in the complex with FANC (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato K, Toda K, Ishiai M, Takata M, Kurumizaka H
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res 巻: (in press)
  • DOI: 10.1093/nar/gks053
  • 査読あり
• [雑誌論文] Establishment of the DNA repair-defective mutants in DT40 cells (2012)
  • 著者名/発表者名: Ishiai M, Uchida E, Takata M
  • 雑誌名: Methods Mol Biol 巻: (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] FancJ/Bripl helicase protects against genomic losses and gains in vertebrate cells (2011)
  • 著者名/発表者名: Kitao H, Nanda I, Sugino RP, Kinomura A, Yamazoe M, Arakawa H, Schmid M, Innan H, Hiom K, Takata M
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 16 ページ: 714-27
  • DOI: 10.1111/j.1365-2443.2011.01523.x
  • 査読あり
• [雑誌論文] The involvement of SLX4 in interstrand cross-link repair is regulated by the Fanconi anemia pathway (2011)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto KY, Kobayashi S, Kurumizaka H, Takata M, Kono K, Jiricny J, Takeda S, Hirota K
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 巻: 108 ページ: 6492-6
  • DOI: 10.1073/pnas.1018487108
  • 査読あり
• [雑誌論文] USP1 deubiquitinase maintains phosphorylated CHK1 by limiting its DDB1-dependent degradation (2011)
  • 著者名/発表者名: Guervilly JH, Renaud E, Takata M, Rosselli F
  • 雑誌名: Hum Mol Genet 巻: 20 ページ: 2171-81
  • DOI: 10.1093/hmg/ddr103
  • 査読あり
• [雑誌論文] The role of SNM1 family nucleases in etoposide-induced apoptosis (2011)
  • 著者名/発表者名: Hosono Y, Abe T, Ishiai M, Takata M, Enomoto T, Seki M
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 410 ページ: 568-73
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2011.06.027
  • 査読あり
• [雑誌論文] Predisposition to cancer caused by genetic and functional defects of Mammalian atad5 (2011)
  • 著者名/発表者名: Bell DW, Sikdar N, Lee KY, Price JC, Chatterjee R, Park HD, Fox J, Ishiai M, Rudd ML, Pollock LM, Fogoros SK, Mohamed H, Hanigan CL; NISC Comparative Sequencing Program, Zhang S, Cruz P, Renaud G, Hansen NF, Cherukuri PF, Borate B, McManus KJ, Stoepel J, Sipahimalani P, Godwin AK, Sgroi DC, Merino MJ, Elliot G, Elkahloun A, Vinson C, Takata M, Mullikin JC, Wolfsberg TG, Hieter P, Lim DS, Myung K
  • 雑誌名: PLoS Genet 巻: 7 ページ: e1002245
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1002245
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct Inhibition of TNF-α Promoter Activity by Fanconi Anemia Protein FANCD2 (2011)
  • 著者名/発表者名: Matsushita N, Endo Y, Sato K, Kurumizaka H, Yamashita T, Takata M, Yanagi S
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 6 ページ: e23324
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0023324
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fanconi anemia : a disorder defective in the DNA damage response (2011)
  • 著者名/発表者名: Kitao H, Takata M
  • 雑誌名: Int J Hematol 巻: 93 ページ: 417-24
  • DOI: 10.1007/s12185-011-0777-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Guest editorial : fanconi anemia and the DNA damage response (2011)
  • 著者名/発表者名: Takata M
  • 雑誌名: Int J Hematol 巻: 93 ページ: 415-6
  • DOI: 10.1007/s12185-011-0832-9
  • 査読あり
• [学会発表] Fanconi anemia and the DNA damage response (2012)
  • 著者名/発表者名: Minoru Takata
  • 学会等名: The Sugahara Memorial International Symposium
  • 発表場所: 稲盛ホール(京都市)(招待講演)
  • 年月日: 20120125-20120126
• [学会発表] DNA損傷への応答メカニズムと疾患 (2012)
  • 著者名/発表者名: 高田穣
  • 学会等名: 第11回分子予防環境医学研究会
  • 発表場所: 倉敷市市民会館(倉敷市)(招待講演)
  • 年月日: 2012-01-27
• [学会発表] Genome Dynamics : molecular network in maintenance and conversion (2011)
  • 著者名/発表者名: 高田穣
  • 学会等名: 日本分子生物学会第34回年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(横浜市)(招待講演)
  • 年月日: 20111214-20111216
• [学会発表] Molecular mechanisms of the Fanconi anemia pathway (2011)
  • 著者名/発表者名: Masamichi Ishiai, Junya Tomida, Tomoko Shigechi, Akiko Itaya, Emi Uchida, Junya Unno, Minoru Takata
  • 学会等名: 日本分子生物学会第34回年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(横浜市)
  • 年月日: 20111214-20111216
• [学会発表] DNA損傷応答シグナルにおけるクロマチン動態とエピジェネティクス制御 (2011)
  • 著者名/発表者名: Minoru Takata
  • 学会等名: 27th RBC-NIRS International Symposium
  • 発表場所: コープイン京都(京都市)(招待講演)
  • 年月日: 20111209-20111210
• [学会発表] An Absolute Requirement of ATRIP-ATR Kinase in Replication Stress-induced Triggering of the FA Pathway Activation (2011)
  • 著者名/発表者名: T.Shigechi, J.Tomida, K.Sato, Y.Zhang, E.Uchida, J.Eykelenbo, N.Lowndes, H.Kurumizaka, Y.Maehara, M.Takata
  • 学会等名: 23rd ANNUAL Fanconi Anemia Research Fund SCIENTIFIC SYMPOSIUM
  • 発表場所: Princesa Sofia Hotel(スペイン)
  • 年月日: 20111020-20111023
• [学会発表] ファンコニ貧血コア複合体によるATR-ATRIPキナーゼのクロマチン動態制御 (2011)
  • 著者名/発表者名: 高田穣、冨田純也、板谷(内田)亜希子、茂地智子、海野純也、前原善彦、石合正道
  • 学会等名: 第70回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場(名古屋市)
  • 年月日: 20111003-20111005
• [学会発表] International session for DNA repair and related subjects (2011)
  • 著者名/発表者名: Takata, M
  • 学会等名: 日本放射線影響学会第54回大会
  • 発表場所: 神戸商工会議所会館(神戸市)(招待講演)
  • 年月日: 2011-11-19
• [学会発表] 放射線被曝医療 (2011)
  • 著者名/発表者名: 高田穣
  • 学会等名: 第28回日本医学会総会講演会特別企画プログラム
  • 発表場所: 東京ビッグサイト(東京都)(招待講演)
  • 年月日: 2011-09-17