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2014 年度 実績報告書

細胞内分子数を定数解析するデバイスの開発-少数生体分子の計数化技術-

計画研究

研究領域少数性生物学―個と多数の狭間が織りなす生命現象の探求―
研究課題/領域番号 23115002
研究機関東京大学

研究代表者

野地 博行  東京大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (00343111)

研究分担者 渡邉 朋信  独立行政法人理化学研究所, 生命システム研究センター, チームリーダー (00375205)
市村 垂生  独立行政法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 研究員 (50600748)
研究期間 (年度) 2011-04-01 – 2016-03-31
キーワードデジタル計測 / 1分子計測 / 超解像顕微鏡 / ウイルス計測
研究実績の概要

本計画研究は、1分子デジタルELISA法を応用した、デジタルバイオアッセイの開発と超解像顕微鏡と2改変型蛍光タンパク質に基づいた1細胞タンパク質計数法、の2つの技術課題を中心に取り組む。
デジタルバイオアッセイの開発:新しいデジタルバイオアッセイとして、インフルエンザウイルス1粒子の検出法の開発に取り組んだ。インフルエンザウイルス表面にあるノイラミニダーゼの活性を指標にして、ドロップレット内のウイルス検出を行ったところ、1粒子ウイルスでも検出可能であることが分かった。また、本法の検出感度は、一般的に用いられている免疫抗体法に比べ10倍から100倍高いことが分かった。また、既存のデジタルアッセイの改良にも取り組んだ。検出用酵素として用いているアルカリフォスファターゼの基質について検討を行った。従来使用している4MUPはアルカリ性条件でしか強い蛍光を発しないため、他の酵素と同時にアッセイすることが困難であった。そこで今回、DiFMUPと言う中性域でも強い蛍光を発する基質を検討したところ、pH7でも十分観察可能な蛍光を得ることが出来た。これにより、βgalactosidaseのような他の酵素と同時にアッセイが可能になるため、マルチカラーデジタルELISAへ発展が可能となる。
高速超解像蛍光顕微鏡の開発:波長分離型の超解像一分子イメージング法の分解能の評価および最適化に取り組み、30msの時間分解能で4nm程度の空間分解能を達成するに至った。筋肉ミオシンの協同的動態の観察に着手し、実験条件の最適化に取り組んだ。また、光スイッチング蛍光蛋白質を用いた走査型超解像イメージング法の開発にも取り組み、原理検証実験において、回折限界を超える空間分解能を達成できることを実験的に示した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本年度は、アッセイのハイスループット化を予定していた。そのため、96穴プレートベースのアッセイ方法の開発を行い、自動分注機を用いてデジタルELISAを行わせることにも成功した。これにより、操作のほとんどを自動化することに成功したが、歩留まりがまだ悪く検討が必要な点もある。さらに、自動解析プログラムの開発にも取り組んだ。このように当所定を順調にこなしていることに加え、ウイルス1粒子検出包の開発など、想定をしていない広がりが出てきている。

今後の研究の推進方策

27年度は、最終年度でもあるため、これまでの成果を発表することに注力する。また、試験的に開始した新しいデジタルアッセイに関しても、推進する。自動化に関しては、問題点の解消を行い、歩留まりの向上に努める。デジタルELISAに関しては、マルチカラーでアッセイを可能にすることで、検出限界の低減を図りさらなる高感度化を目指す。
波長分離型の超解像一分子イメージング法の開発では、筋肉のミオシンの協働的動態の観察に集中的に取り組む。公募研究チームとの共同研究として取り組み、今後の応用研究の可能性を探る。光スイッチングタンパク質を用いた超解像法の開発においては、細胞内イメージングへと展開する。また、光スイッチングタンパク質を用いて、細胞内の拡散情報の取得が可能であることを最近提案しており、原理検証実験に取り組む。最終的に、光スイッチング蛍光タンパク質を利用した、新規細胞内分子動態のナノイメージング法として取りまとめる。

  • 研究成果

    (23件)

すべて 2015 2014

すべて 雑誌論文 (19件) (うち査読あり 19件、 オープンアクセス 18件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (4件) (うち招待講演 4件)

  • [雑誌論文] Comprehensive chemical secretory measurement of single cells trapped in a micro-droplet array with mass spectrometry2015

    • 著者名/発表者名
      Hideaki Fujita, Tsuyoshi Esaki, Tsutomu Masujima, Akitsu Hotta, Soo Hyeon Kim, Hiroyuki Noji, Tomonobu M. Watanabe
    • 雑誌名

      RSC Adv.

      巻: 5 ページ: 16968-16971

    • DOI

      10.1039/C4RA12021C

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] ラマン顕微鏡による細胞状態の計測2014

    • 著者名/発表者名
      市村垂生
    • 雑誌名

      生物物理

      巻: 54 ページ: 315-317

    • DOI

      10.2142/biophys.54.315

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Nano-scale measurement of biomolecules by optical microscopy and semiconductor nanoparticles2014

    • 著者名/発表者名
      Taro Ichimura, Takashi Jin, Hideaki Fujita, Hideo Higuchi, Tomonobu M. Watanabe
    • 雑誌名

      Front. Physiol., fphys.

      巻: 5 ページ: 273_1-13

    • DOI

      10.3389/fphys.2014.00273

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Gene dynamics of core transcription factors for pluripotency in embryonic stem cells2014

    • 著者名/発表者名
      Brit G. David, Kazuko Okamoto, Taishi Kakizuka, Taro Ichimura, Tomonobu M. Watanabe, Hideaki Fujita
    • 雑誌名

      J. Biosci. Bioeng

      巻: 119 ページ: 406-409

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2014.09.011

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Culturing of mouse and human cells on soft substrates promote the expression of stem cell markers2014

    • 著者名/発表者名
      Sayaka Higuchi, Tomonobu M. Watanabe, Keiko Kawauchi, Taro Ichimura, Hideaki Fujita
    • 雑誌名

      J Biosci Bioeng

      巻: 117 ページ: 749-75

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2013.11.011

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Single-molecule imaging analysis of elementary reaction steps of Trichoderma Reesei cellobiohydrolase I (Cel7A) hydrolyzing crystalline cellulose Iα and IIII2014

    • 著者名/発表者名
      Shibafuji Y, Nakamura A, Uchihashi T, Sugimoto N, Fukuda S, Watanabe H, Samejima M, Ando T, Noji H, Koivula A, Igarashi K and Iino R
    • 雑誌名

      J Biol Chem

      巻: 289 ページ: 14056-14065

    • DOI

      10.1074/jbc.M113.546085

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Characterization of the temperature-sensitive reaction of F1-ATPase by using single molecule manipulation2014

    • 著者名/発表者名
      Watanabe R and Noji H
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 4 ページ: 4962_1-6

    • DOI

      10.1038/srep04962

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Timing of inorganic phosphate release modulates the catalytic activity of ATP-driven rotary motor protein2014

    • 著者名/発表者名
      Watanabe R and Noji H
    • 雑誌名

      Nature Communications

      巻: 5 ページ: 3486

    • DOI

      10.1038/ncomms4486

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] F1subunit reinforces torque generation in V-ATPase2014

    • 著者名/発表者名
      Junichi Kishikawa, Akihiko Seino, Atsuko Nakanishi, Naciye Esma Tirtom, Hiroyuki Noji, Ken Yokoyama, Kumiko Hayashi
    • 雑誌名

      European Biophysics Journal

      巻: 43 ページ: 415-422

    • DOI

      10.1007/s00249-014-0973-x

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Torque generation mechanism of F1-ATPase upon NTP binding2014

    • 著者名/発表者名
      Arai HC, Yukawa A, Iwatate JR, Kamiya M, Watanabe R, Urano Y and Noji H
    • 雑誌名

      Biophys J

      巻: 107 ページ: 156-164

    • DOI

      10.1016/j.bpj.2014.05.016

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Real-Time Fluorescence Visualization of Slow Tautomerization of Single Free-Base Phthalocyanines under Ambient Conditions2014

    • 著者名/発表者名
      Ikeda T, Iino R and Noji H
    • 雑誌名

      Chem. Commun

      巻: 50 ページ: 9443-9446

    • DOI

      10.1039/c4cc02574a

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Motion Capture and Manipulation of Single Synthetic Molecular Rotors by Optical Microscopy2014

    • 著者名/発表者名
      Ikeda T, Tsukahara T, Iino R, Takeuchi M and Noji H
    • 雑誌名

      Angew.Chem.Int.Ed

      巻: 53 ページ: 10082-10085

    • DOI

      10.1002/ange.201403091

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Robustness of the Rotary Catalysis Mechanism of F1-ATPase2014

    • 著者名/発表者名
      Watanabe R, Matsukage Y, Yukawa A, Tabata KV and Noji H
    • 雑誌名

      J Biol Chem

      巻: 289 ページ: 19331-19340

    • DOI

      10.1074/jbc.M114.569905

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Arrayed Lipid Bilayer Chambers Allow Single-Molecule Analysis of Membrane Transporter Activity2014

    • 著者名/発表者名
      Watanabe R, Soga N, Fujita D, Tabata KV, Yamauchi L, Kim SH, Asanuma D, Kamiya M, Urano Y, Suga H and Noji H
    • 雑誌名

      Nature Communications

      巻: 5 ページ: 4519

    • DOI

      10.1038/ncomms5519

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging2014

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Yaginuma, Shinnosuke Kawai, Kazuhito V. Tabata, Keisuke Tomiyama, Akira Kakizuka, Tamiki Komatsuzaki, Hiroyuki Noji, and Hiromi Imamura
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 4 ページ: 6522_1-7

    • DOI

      10.1038/srep06522

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Thermodynamic analysis of F1-ATPase rotary catalysis using high-speed imaging2014

    • 著者名/発表者名
      Watanabe R, Minagawa Y and Noji H
    • 雑誌名

      Protein Science

      巻: 23 ページ: 1773-1779

    • DOI

      10.1002/pro.2559

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Torque generation of Enterococcus hirae V-ATPase2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroshi Ueno, Yoshihiro Minagawa, Mayu Hara, Suhaila Rahman, Ichiro Yamato, Eiro Muneyuki, Hiroyuki Noji, Takeshi Murata and Ryota Iino
    • 雑誌名

      J Biol Chem

      巻: 289 ページ: 31212-31223

    • DOI

      10.1074/jbc.M114.598177

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] High-throughput formation of lipid bilayer membrane arrays with an asymmetric lipid composition2014

    • 著者名/発表者名
      Rikiya Watanabe, Naoki Soga, Tomoko Yamanaka, & Hiroyuki Noji
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 4 ページ: 7076_1-6

    • DOI

      10.1038/srep07076

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Key Chemical Factors of Arginine Finger Catalysis of F1-ATPase Clarified by an Unnatural Amino Acid Mutation2014

    • 著者名/発表者名
      Yukawa A, Iino R, Watanabe R, Hayashi S and Noji H
    • 雑誌名

      Biochemistry

      巻: 54 ページ: 472-480

    • DOI

      10.1021/bi501138b

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Single-molecule biophysics on ATP synthase2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Noji
    • 学会等名
      2014 International Biophysics Congress(IUPAB2014)
    • 発表場所
      Brisbane Convention & Exhibition Centre(Brisbane, Australia)
    • 年月日
      2014-08-07
    • 招待講演
  • [学会発表] Arrayed Lipid Bilayer Chamber for single-molecule analysis of transporters2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Noji
    • 学会等名
      European Bioenergetics Conference(EBEC2014)
    • 発表場所
      Faculdade de Ciencias(Lisbon, Portugal)
    • 年月日
      2014-07-13
    • 招待講演
  • [学会発表] Single-Molecule Digital ELISA and Prospects of its Applications2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Noji
    • 学会等名
      World Lecture Series on Micro/Nanofluidics
    • 発表場所
      Keio University(Kanagawa, Japan)
    • 年月日
      2014-07-02
    • 招待講演
  • [学会発表] Torque generation mechanism of F1-ATPase2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Noji
    • 学会等名
      Tokyo ATPase Workshop(TAW)
    • 発表場所
      The University of Tokyo (Tokyo, Japan)
    • 年月日
      2014-06-02
    • 招待講演

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公開日: 2016-06-01  

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