| 研究領域 | 少数性生物学―個と多数の狭間が織りなす生命現象の探求― |
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| 研究課題/領域番号 |
23115008
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
今田 勝巳 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (40346143)
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| 研究分担者 |
南野 徹 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (20402993)
内橋 貴之 金沢大学, 数物科学系, 准教授 (30326300)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 分子機械 / 生物物理 / ナノバイオ / 生体分子 / 蛋白質 |
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| 研究実績の概要 |
細菌べん毛蛋白質輸送システムは多機能性分子で構成され、各々が少数分子のターンオーバーにより機能する。本研究では、このシステムを再構築し、システムの構造を明らかにすると共に、構成要素の数、種類、エネルギー源に操作を加えて応答を観測し、構成サブユニットがターンオーバーしながら作動する機構、基質蛋白質数をモニターしながら発現系にフィードバックする機構の解明を目指している。以下に今年度の成果を記す。
(1) FliH-Iバイパス変異にクラスII蛋白質輸送にロックした変異を持つ輸送装置とプロトンポンプを発現する菌体を作成し、この反転小胞膜の作成に成功した。(2) 少数性分子であるFliT、FlgN、FliJの数と動態を調べるため、mCherryを用いた蛍光融合蛋白質を作成し、FliTとFlgNは機能を有することを確認した。しかしFliJは機能しなかったため、蛍光色素ReASHで標識するためのテトラシステインタグを導入し、タグがFliJの機能発現に影響しないこと、ReASHによる蛍光染色を確認した。(3) FlhAを中心とした相互作用を解析し、FliJ-FlgN-FlgK複合体がFlhAと相互作用すると、FliJはFlgN-FlgK複合体から解離し、FlgN-FlgK複合体はFlhAのC末細胞質ドメイン（FlhAC）へ、FliJはFlhACとその膜貫通領域を繋ぐリンカー領域に結合することが明らかとなった。(4) 細胞表面観察と一分子計測に向けて、昨年度に製作した広範囲スキャナーおよび高速AFM/蛍光顕微鏡複合装置の調整を行い、AFM探針の細胞表面への位置決め、一分子スケールでAFMと蛍光像を同視野・同時観察ができるようになった。(5) 高速AFMを用いてべん毛輸送タンパク質複合体を観察し、FliI複合体が6回回転対称ではなく、２量体が３つ配置してリング状であることを示唆する結果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度、基部体精製に必須な高圧ホモジェナイザーの納入が、メーカー都合により当初予定より大幅に遅れ、輸送装置複合体精製条件および反転膜作成条件の探索が進まなかったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
・昨年度までに作成した反転小胞膜を用い、輸送測定を試みる。輸送が確認できれば、変異を持たないものについて同様の系を作成し、可溶性性成分や基質量を変化させて輸送を測定する。
・六種類の膜蛋白質の発現と精製を無細胞系を中心に進める。
・高速AFMでFliI複合体のヌクレオチド依存的構造変化を観察する。また、スフェロプラストの基板への展開法を検討し、細胞膜中でのべん毛輸送複合体の観察を試みる。さらに、高速AFM/蛍光顕微鏡複合機により菌体表面でのべん毛成長過程の観察を行う。
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