ゲノム配列情報とエピゲノム情報の維持・変異のクロスレギュレーション

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: 生命素子による転写環境とエネルギー代謝のクロストーク制御
• 研究課題/領域番号: 23116008
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 菅澤 薫 神戸大学, 自然科学系先端融合研究環バイオシグナル研究センター, 教授 (70202124)
• 研究期間 (年度): 2011-07-25 – 2016-03-31
• キーワード: 遺伝子 / エピゲノム / 発現制御 / DNA損傷修復 / 変異

研究概要

１．DNA損傷修復制御におけるエピゲノム環境の役割
哺乳類のヌクレオチド除去修復におけるDNA損傷認識タンパク質であるXPCやDDB2を標的とするクロマチン免疫沈降（ChIP）により、ある種のアセチル化ヒストンが紫外線誘発DNA損傷の認識の場から積極的に排除されている可能性が見出された。細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤処理することで、XPCの紫外線損傷部位へのリクルートの遅延、および細胞全体における損傷修復速度の低下が見られ、ヘテロクロマチン様の構造がDNA修復に対して促進的に作用する可能性が示唆された。一方、DDB2のN末端テール領域においてさまざまな翻訳後修飾の標的となる複数のリジン残基に変異を導入することにより、DNA修復活性とは独立して紫外線に対する細胞の感受性や遺伝子発現パターンが変化することを見出した。
２．エピゲノム制御におけるDNA修復機構の役割
自然突然変異の抑制、および能動的DNA脱メチル化への関与が示唆されている塩基除去修復因子チミンDNAグリコシラーゼ（TDG）が、細胞を紫外線や過酸化水素水、メチルメタンスルホン酸などのDNA損傷剤で処理することでユビキチン-プロテアソーム系による分解を受けることを見出し、この過程に関わるユビキチンリガーゼの同定、および精製タンパク質因子によるユビキチン化反応の再構成に成功した。一方、DNAやRNAの内因性メチル化損傷の修復に関わる大腸菌AlkBの哺乳類ホモログ（ALKBH2/3）を過剰発現、および発現抑制した安定形質転換細胞株についてメタボローム解析を行い、ALKBHの発現レベルが特異的な細胞内代謝経路に影響を与える可能性を見出した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

１．DNA損傷修復制御におけるエピゲノム環境の役割
DNA損傷認識の場におけるヒストン修飾のChIPによる解析がほぼ終了し、その結果に基づいて遺伝子発現に対して抑制的に働くとされるヘテロクロマチン様構造がDNA修復においてはむしろ促進的に作用するという、予想外ではあるがきわめて興味深い結果を得つつある。一方、DDB2のN末端テール領域における翻訳後修飾に関する知見は、修復のための損傷認識と転写環境の再構築を結ぶシグナル伝達経路の理解につながる可能性がある。このように、この部分の研究は順調に進んでいる。
２．エピゲノム制御におけるDNA修復機構の役割
TDGのDNA損傷誘導性分解の分子機構については、関与するユビキチンリガーゼの同定とユビキチン化反応の試験管内再構成に成功した。DNA複製や修復時にTDGが分解されないことがエピゲノム情報の消去につながるとの作業仮説に基づき、分解耐性の変異TDGの作成、およびDNAメチル化状態や遺伝子発現パターンを解析するための材料は整いつつある。ALKBHの機能解析に関してもSAMレベルの人為的操作のための条件検討が進んでおり、研究全体としては概ね順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

１．DNA損傷修復制御におけるエピゲノム環境の役割
NERにおけるヒストン脱アセチル化酵素の役割をより詳しく調べるため、siRNAライブラリーを用いて実際にNERに関わる分子種の同定を行う。また、他にヘテロクロマチン構造形成に関与することが知られているHP1やヒストンメチル化酵素等についてXPC、DDB2との相互作用、およびNERにおける機能解析を進める。また、N末端テール領域に変異を導入したDDB2を安定発現する細胞株において、p53の有無が細胞のDNA損傷応答や遺伝子発現制御に与える影響を比較解析する。
２．エピゲノム制御におけるDNA修復機構の役割
Tdg遺伝子欠損マウス線維芽細胞を親株として、野生型および分解耐性型TDGを安定発現する細胞株を作成し、複製や修復に伴うDNAメチル化状態、および遺伝子発現パターンへの影響を調べる。またタグを利用した複合体精製、および質量分析により、TDGと相互作用する新規因子の探索を進める。さらにALKBH2/3の発現レベルを人為的に操作した細胞を用いて自然突然変異、トランスクリプトーム、メタボローム解析を進めるとともに、SAMレベルの変動がこれらの細胞の表現型に与える影響を解析する。

研究成果

• [雑誌論文] PRDM14 promotes active DNA demethylation through the Ten-eleven translocation (TET)-mediated base excision repair pathway in embryonic stem cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Okashita, N., Kumaki, Y., Ebi, K., Nishi, M., Okamoto, Y., Nakayama, M., Hashimoto, S., Nakamura, T., Sugasawa, K., Kojima, N., Takada, T., Okano, M. and Seki, Y.
  • 雑誌名: Development 巻: 141 ページ: 269-280
  • DOI: 10.1242/dev.099622.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Comparative analysis of interaction of human and yeast DNA damage recognition complexes with damaged DNA in nucleotide excision repair. (2013)
  • 著者名/発表者名: Krasikova, Y. S., Rechkunova, N. I., Maltseva, E. A., Pestryakov, P. E., Petruseva, I. O., Sugasawa, K., Chen, X., Min, J. H. and Lavrik, O. I.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 288 ページ: 10936-10947
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.444026.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure-function analysis of the EF-hand protein centrin-2 for its intracellular localization and nucleotide excision repair. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishi, R., Sakai, W., Tone, D., Hanaoka, F. and Sugasawa, K.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research 巻: 41 ページ: 6917-6929
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-12-3154.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure-specific endonucleases xpf and mus81 play overlapping but essential roles in DNA repair by homologous recombination. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi, K., Narita, T., Pham, V. T., Iijima, J., Hirota, K., Keka, I. S., Mohiuddin, Okawa, K., Hori, T., Fukagawa, T., Essers, J., Kanaar, R., Whitby, M. C., Sugasawa, K., Taniguchi, Y., Kitagawa, K. and Takeda, S.
  • 雑誌名: Cancer Research 巻: 73 ページ: 4362-4371
  • DOI: 10.1093/nar/gkt434.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Human and yeast DNA damage recognition complexes bind with high affinity DNA structures mimicking in size transcription bubble. (2013)
  • 著者名/発表者名: Krasikova, Y. S., Rechkunova, N. I., Maltseva, E. A., Anarbaev, R. O., Pestryakov, P. E., Sugasawa, K., Min, J. H. and Lavrik, O. I.
  • 雑誌名: Journal of Molecular Recognition 巻: 26 ページ: 653-661
  • DOI: 10.1002/jmr.2308.
  • 査読あり
• [学会発表] 哺乳類ヌクレオチド除去修復におけるDNA損傷認識過程の制御 (2013)
  • 著者名/発表者名: 菅澤 薫
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] 酸化的脱メチル化酵素ALKBH2/3の発現変化が細胞増殖・代謝に及ぼす影響 (2013)
  • 著者名/発表者名: 稲瀬安希、入野康宏、加香孝一郎、小島真梨子、深水昭吉、菅澤 薫
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] DNA修復とエピゲノム制御に関わるチミンDNAグリコシラーゼの機能制御 (2013)
  • 著者名/発表者名: 中村知史、村上浩一、上原芳彦、小野哲也、浦野 健、西谷秀男、菅澤 薫
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] ヌクレオチド除去修復の損傷認識に関わるクロマチン構造制御 (2013)
  • 著者名/発表者名: 中西正哉、酒井 恒、白鳥広海、木村 宏、菅澤 薫
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] Manipulated expression of the oxidative DNA/RNA demethylation enzymes ALKBH2/3 alters cellular proliferation and metabolism. (2013)
  • 著者名/発表者名: Inase, A., Irino, Y., Kako, K., Kojima, M., Fukamizu, A. and Sugasawa, K.
  • 学会等名: International Symposium on Transcription and Metabolism
  • 発表場所: 淡路夢舞台国際会議場
  • 年月日: 20131111-20131113
• [学会発表] Functional regulation of thymine DNA glycosylase involved in DNA repair and epigenetic reprogramming. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakamura, T., Murakami, K., Uehara, Y., Ono, T., Urano, T., Nishitani, T. and Sugasawa, K.
  • 学会等名: International Symposium on Transcription and Metabolism
  • 発表場所: 淡路夢舞台国際会議場
  • 年月日: 20131111-20131113
• [学会発表] Chromatin structure regulating DNA damage recognition in nucleotide excision repair. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakanishi, S., Sakai, W., Shiratori, H., Kimura, H. and Sugasawa, K.
  • 学会等名: International Symposium on Transcription and Metabolism
  • 発表場所: 淡路夢舞台国際会議場
  • 年月日: 20131111-20131113
• [学会発表] ゲノムDNA損傷の修復と細胞応答を制御するタンパク質翻訳後修飾の役割 (2013)
  • 著者名/発表者名: 菅澤 薫
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 20130911-20130913
• [備考] 神戸大学バイオシグナル研究センター 菅澤研究室
  • URL: http://www.research.kobe-u.ac.jp/brce-sugasawa/