| 研究領域 | プラズマ医療科学の創成 |
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| 研究課題/領域番号 |
24108004
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
金子 俊郎 東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (30312599)
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| 研究分担者 |
佐藤 岳彦 東北大学, 流体科学研究所, 教授 (10302225)
加藤 俊顕 東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 講師 (20502082)
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| 研究期間 (年度) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| キーワード | ナノプラズマ / カーボンナノチューブ / 遺伝子導入 / 生体機能制御 / 局所プラズマ照射 |
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| 研究実績の概要 |
カーボンナノチューブ（CNT）先端にナノサイズのプラズマを生成・制御する技術を創製し，ナノプラズマ局所照射により生体機能を制御することで，高効率・低侵襲の新しい遺伝子治療技術を開発することを目的として，３年目はナノサイズの金属針状電極を用いた液中微小プラズマ生成とその計測を行うとともに，遺伝子模擬蛍光物質の細胞内への導入に対するプラズマ照射距離の効果の解明を目指して実験を行った．
1. 純水および生理食塩水で満たした石英セル内に，先端曲率半径を1 μm以下に制御した金属針状電極を挿入し，プラズマ生成を行った．電極先端曲率半径を小さくすることで，放電開始電圧を，生体内でも安全に使用できる500 V以下に低下できることを明らかにした．また，生理食塩水中での放電の様子を観測し，直径が数μｍ程度の円柱状気泡内放電が生じていることを明らかにした．
2. CNT内部へ実際の遺伝子であるsiRNAおよびプラスミドDNAを挿入するために，直径を精密に制御したCNTの合成を行った．パルスプラズマCVD法を用いて，プラズマのオン時間とオフ時間の比を制御することで，直径分布の狭いCNTを合成することに成功した．CNTへの遺伝子の挿入，および細胞へのCNTの導入のしやすさの観点から，今後，最適な直径のCNTを決定する．
3. 大気圧ヘリウムプラズマを浮遊細胞と蛍光物質を混合した懸濁液に照射した場合に，プラズマ生成領域と細胞懸濁液との距離を短くするに従い導入効率が増大することを明らかにした．これは気相中での寿命が短い活性種および荷電粒子が遺伝子導入に寄与しているためと考えている．また，接着細胞を用いて，プラズマ照射液面と細胞との距離を変化させたところ，1mm程度以下で導入効率が急激に増大し，導入効率が80%を超えることが明らかとなった．プラズマ照射により液中に生成される短寿命の活性種および荷電粒子が導入効率向上に極めて効果的であることが判明した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
ナノプラズマ生成に関しては，ナノメートルサイズの金属針状電極を用いて，直径が数μmの微小プラズマ生成に成功しており，ナノプラズマの生成実現にほぼ到達している．また，実際の体内を想定した生理食塩水中での微小プラズマ生成にも成功しており，当初の計画以上に進展していると言える．細胞への遺伝子導入技術開発においては，プラズマ照射による蛍光物質の導入について，プラズマ照射距離の依存性を明らかにしたことによって，極短寿命の活性種および荷電粒子が遺伝子導入に重要な役割を果たしていることを明らかにし，プラズマによる遺伝子導入のメカニズム解明に迫っており，当初の計画以上に進展していると言える．
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| 今後の研究の推進方策 |
ナノプラズマ生成に関しては，金属の微小針状電極を作製することで微小プラズマの生成が実現しているので，さらに金属針状電極上にCNTを成長させて，CNT先端でのナノプラズマ生成を実証する．生成されるプラズマの大きさがナノサイズになることで，プラズマの発光の観測が困難になることが予想されるため，蛍光ナノ粒子等を用いてプラズマ発光を増強し，CNT先端でのナノプラズマ生成のダイナミクスを解明する．
遺伝子のCNTへの内包・輸送・放出手法開発に関しては，実際の遺伝子であるsiRNAやプラスミドDNA等をCNTに内包させる．各々の遺伝子に最適な直径のCNTをパルスプラズマ法を用いて合成し，そのCNTにプラスミドDNA等の内包実験を行うとともに，内直径の大きいCNTが小さいCNTと同様に細胞内に挿入されるかどうかについても検証する．
細胞への遺伝子導入技術開発については，これまでに成功している微小プラズマを細胞膜表面で生成して照射し，そのときの細胞膜輸送の変化を観測する．この細胞膜輸送の変化が，プラズマで発生する活性種，電界，紫外線，衝撃波などの何に起因して生じるかについて詳細に調べる．プラズマ照射による細胞膜輸送を詳細に調べるため，リアルタイムイメージングにより細胞内の種々の物質密度の過渡応答を観測する．具体的には，細胞活動に重要な役割を果たすカルシウムイオン，一酸化窒素，水酸基ラジカル等の密度をプローブ蛍光色素を用いて細胞内で観測し，プラズマ照射後の経過時間に対する依存性を観測する．
また，表面修飾されたCNTが細胞膜を通過できる性質を利用して，細胞内に挿入したCNTの先端でナノプラズマを生成し，遺伝子を放出することで細胞質内に遺伝子を直接導入できることを示す．このとき，プローブ蛍光色素を細胞内に導入しておき，細胞内でのプラズマ生成によってカルシウムイオンや水酸基ラジカル等がどのように変化するかに注目する．
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