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2012 年度 実績報告書

生体酵素系に生成する感応性化学種の同定と機能解明

計画研究

研究領域感応性化学種が拓く新物質科学
研究課題/領域番号 24109017
研究機関大阪大学

研究代表者

井上 豪  大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20263204)

研究分担者 中村 努  独立行政法人産業技術総合研究所, 健康工学研究部門, 主任研究員 (10357668)
松村 浩由  大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30324809)
研究期間 (年度) 2012-06-28 – 2017-03-31
キーワードペルオキシレドキシン / スーパーオキシドディスムターゼ / 反応機構解明 / 中性子線構造解析 / Ⅹ線構造解析
研究実績の概要

超好熱性古細菌A. pernix K1由来ペルオキシレドキシン(ApPrx)が過酸化水素を水に還元するという活性の発現には、反応中心のシステイン残基(peroxidaticCys, Cp)とともに近傍のヒスチジン残基(His)が必須である。Cpのチオール基が過酸化水素を攻撃するさいに、その硫黄原子がHis側鎖の窒素原子と共有結合し、超原子価中間体(S-OH中間体)を形成する。本研究課題では、S-OH中間体の中性子線構造解析、およびS-OH中間体前後の過程の低温トラップ法による時分割X線構造解析を行い、詳細な反応機構の解明を目指す。また、新たな標的であるA. pernix K1由来の金属酵素スーパーオキシドディスムターゼ(ApeSOD)がスーパーオキシドアニオンラジカル(・O2-)を酸素と過酸化水素に不均化する反応の詳細な機構の解明をも目指す。
ApPrxのS-OH中間体は、硫黄原子のまわりの水素原子と不対電子の位置関係や、イミダゾール部分のプロトン化状態など、未だ観測されていない課題がある。また、SODの基質(・O2-)と生成物(O2, H2O2)はすべて酸素原子2個からなっており、X線結晶解析では区別がつかない。したがって、中性子回折を利用した構造解析が必要である。通常、中性子構造解析のためには1 mm角を超える大型の高品質結晶が必要となるため、24年度はApPrxの大量精製、ミクロ種結晶化法、マクロ種結晶化法を駆使した種結晶化を繰り返し、大型結晶育成のための結晶化実験に取り組んた。いずれも多結晶化が起こり、中性子線回折実験には至っていない。一方、ApeSODについても同様に大型結晶の作製に取り組んだ。これに成功すれば、直ちに構造解析を試み、反応機構の解明にも取り組む予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

申請当初の計画通り、専属の研究員を採用することができ、また様々な分子種の相互作用を測定できる等温滴定カロリメトリー装置を導入できたこ とによって、研究はおおむね順調に進展していると考えている。
ただし、大型の高品質結晶の育成では多結晶化が問題となっており、新たな蛋白質 コンストラクトの作成や大型結晶育成技術の構築が今後の課題である。
また、中性子構造解析が困難な場合に備えて、高分解能X線解析によってより詳細な反応機構を解明することも必要であると考えている。

今後の研究の推進方策

本研究は、超好熱性古細菌Aeropyrumpernix K1由来ペルオキシレドキシン(ApPrx)の酸化反応中に生成する超原子価中間体(スルフラン中間体)の解析を中心に置いている。平成25年度は、Prxにおけるスルフラン中間体の一般性を明らかにすること、ApPrxの中性子解析を容易にすること、の2点を目標にして研究を推進する。
ApPrxのスルフラン中間体は、活性中心のシステイン残基(peroxidaticCys, Cp)と、その8残基上流にあるヒスチジン残基(His)が共有結合し、さらに過酸化水素由来の水酸基が加わった構造をしている。ところがそのHis残基はPrx全てに保存されているのではなく、Prxを6種類に分類したときの1つのグループ(Prx6)のみに保存されている。古細菌由来のPrxはPrx6に分類され、Hisが保存されている。ならば、スルフラン中間体はPrx反応の進化初期においては一般的であったのだろうか。この問いに答えるため、嫌気性超好熱性古細菌Pyrococcusfuriosus由来Prxの構造解析を開始し、スルフラン中間体の検出を目指す。
タンパク質の中性子解析には大型結晶が必要であり、ApPrxの結晶の大型化には従来から取り組んでいるところである。一方で、中性子解析を容易にするファクターは結晶の大きさだけではなく、格子定数の小ささ、対称性の高さなども考慮する必要がある。ApPrxはリング状の十量体であり、その結晶は空間群P1で、その非対称単位には10分子入っている。この現状では、格子定数・対称性ともに中性子解析には適していない。そこで、変異解析によりApPrxを二量体化し、より中性子解析に適した結晶を得ることを目標とする。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (5件) 備考 (3件)

  • [雑誌論文] Crystal structure of rice Rubisco and implications for activation induced by positive effectors NADPH and 6-phosphogluconate2012

    • 著者名/発表者名
      Hiroyoshi Matsumura
    • 雑誌名

      J. Mol. Biol.,

      巻: 422(1) ページ: 75-86

    • DOI

      10.1016/j.jmb.2012.05.014

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Spatially precise, soft microseeding of single protein crystalsby femtosecond laser ablation2012

    • 著者名/発表者名
      Hiroshi Yoshikawa
    • 雑誌名

      Cryst. Growth Des.,

      巻: 12(9) ページ: 4334-4339

    • DOI

      10.1021/cg300018t

    • 査読あり
  • [学会発表] Growth of High-Quality and Large Protein Crystals for Neutron Crystallography2013

    • 著者名/発表者名
      Hiroyoshi Matsumura
    • 学会等名
      感応性化学種が拓く新物質科学 第1回国際シンポジウム
    • 発表場所
      メルパルク広島
    • 年月日
      2013-03-26 – 2013-03-27
  • [学会発表] Hypervalent Intermediate Observed during Oxidation of Peroxiredoxin from an Aerobic Hyperthermophilic Archaeon Aeropyrum pernix K12013

    • 著者名/発表者名
      Tsuyoshi Inoue
    • 学会等名
      感応性化学種が拓く新物質科学 第1回国際シンポジウム
    • 発表場所
      メルパルク広島
    • 年月日
      2013-03-26 – 2013-03-27
  • [学会発表] Crystal structure of Archaeal Peroxiredoxin from an Anaerobic Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus horikoshii2013

    • 著者名/発表者名
      Tsutomu Nakamura
    • 学会等名
      感応性化学種が拓く新物質科学 第1回国際シンポジウム
    • 発表場所
      メルパルク広島
    • 年月日
      2013-03-26 – 2013-03-27
  • [学会発表] 嫌気性古細菌由来ペルオキシレドキシンの結晶化と構造解析2013

    • 著者名/発表者名
      中村 努
    • 学会等名
      第12 回 産総研・産技連LS-BT 合同研究発表会
    • 発表場所
      産総研つくばセンター
    • 年月日
      2013-02-05 – 2013-02-06
  • [学会発表] 生体酵素系に生成する感応性化学種の同定と機能解明2012

    • 著者名/発表者名
      井上 豪
    • 学会等名
      感応性化学種が拓く新物質科学 第1回公開シンポジウム
    • 発表場所
      京都大学・宇治おうばくプラザ・きはだホール
    • 年月日
      2012-09-29 – 2012-09-29
  • [備考] 井上豪Home Page

    • URL

      http://www.chem.eng.osaka-u.ac.jp/~inoue-tken/ja/staffs/inoue/index.html

  • [備考] Hiroyoshi Matsumura (松村 浩由) Homepage

    • URL

      http://www.chem.eng.osaka-u.ac.jp/~inoue-tken/ja/staffs/matsumura/

  • [備考] 中村努Home Page

    • URL

      http://unit.aist.go.jp/hri/group/bmd-rg/member/nakamura.htm

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公開日: 2018-02-02  

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