生体酵素系に生成する感応性化学種の同定と機能解明

2015 年度 実績報告書

• 研究領域: 感応性化学種が拓く新物質科学
• 研究課題/領域番号: 24109017
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 井上 豪 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20263204)
• 研究分担者: 中村 努 国立研究開発法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (10357668) ; 松村 浩由 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324809)
• 研究期間 (年度): 2012-06-28 – 2017-03-31
• キーワード: チオレドキシンペルオキシダーゼ / 還元反応 / 酵素反応 / 反応中間体 / Ⅹ線構造解析 / 中性子線解析 / Ⅹ線自由電子レーザー / SACLA

研究実績の概要

生体系では、酵素触媒反応の過程で一過的に感応性化学種が生成し、特異な機能を発揮することがある。本研究では、チオレドキシンペルオキシダーゼ中のチオール残基が過酸化水素と反応する際に生成する、超原子価硫黄原子を含むS-OH中間体の構造を中性子回折法でも直接観測し、その機能を解明するとともに、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)で生成する一過的な金属配位構造も同定する。
平成27年度は、超好熱性古細菌A. pernix K1由来ペルオキシレドキシン(ApPrx)やA. pernix K1由来の金属酵素スーパーオキシドディスムターゼ(ApeS OD)の反応中間体の中性子線構造解析や、低温トラップ法による時分割X線構造解析により詳細な反応機構の解明を目指し、H26年度に続いて中性子構造解析のための1 mm角を超える高品質結晶の結晶化を試みたが、a軸方向のモザイク性が極めて高く、その方向に対する結晶の劈開性の為に大型化が困難であり、種結晶化法も極めて困難であることが判った。いずれも多結晶化のため中性子線回折の実験には至らなかった。
一方、時分割構造解析の 可能性を秘めたSACLAのX線自由電子レーザーを用いたⅩ線構造解析（文科省重点戦略研究課題【代表：岩田想】との共同研究）も昨年度と同様に推進し、亜硝酸還元酵素NIRの結晶構造解析を行い、基質複合体の無損傷Ⅹ線構造解析に成功し、反応機構の詳細が明らかとなった（米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（略称PNAS）に掲載され、各種メディアからも報道された）。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

中性子構造解析のため1 mm角を超える大型の高品質結晶の取得を目指し、大量精製されたApTPxの結晶化を行った。0.2～0.4mmのサイズの結晶を得て後、これを細かく砕いて種とするミクロ種結晶化法や、そのまま次のバッチの中に浸漬するマクロ種結晶化法などを駆使し、何度も種結晶化を試した。しかし、マクロ種結晶の段階で結晶が劈開すると共に、モザイク性が上昇し、良質結晶の取得には至らず、中性子回折実験には着手できなかった。
結晶形の変化を期待してMutation実験を試みたが、今のところパッキングを変化させる変異体の作製には至っていない。
一方、由来の異なる超好熱始原菌（Pyrococcus horikoshi）由来TPxについても同様にS-OH中間体を経て反応が進行するものと考え、結晶構造解析を行ったところ、過酸化水素の添加に伴うS-OH中間体の生成を直接捉えるには至らなかったものの、本中間体を経て反応が進行したと思われる痕跡状態を構造解析によって明らかとし、以前と同様の反応機構で還元反応が進行することが判った。そこでP. horikoshi由来のTPxについても大型結晶の調製を試みているが、未だ中性子線解析に適した大型結晶を得るには至っていない。
一方、SACLAにおけるX線自由電子レーザー（文科省重点戦略研究課題【代表：岩田想】との共同研究）こそが、S-OH中間体の反応性や酵素の詳細な反応機構の解明に向けた重要技術となると考え、その技術の積極導入に注力している。その結果、別の酵素ではあるが、亜硝酸還元酵素のNIRを用いた場合に、世界初で無損傷状態の構造解析に成功し、反応前の初期構造を詳細に解析するに至っている（Fukuda Y. et al., PNAS, 113(11), 2928-2933, 2016）。本手法を用いれば、将来的にはS-OH中間体からの構造変化などを詳細に解析できると期待している。

今後の研究の推進方策

S-OH中間体の構造の証明には中性子線構造解析による硫黄原子上にある水素原子の直接観察が必須となる。
引き続き、ApTPxについてパッキングに関係するところのアミノ酸に変異を加えた実験を行い、大量精製及び結晶化を行い、結晶形の異なる大型結晶化を目指す。一方、種の異なるP. horikoshi由来TPxを用いた場合にも、S-OH中間体の捕捉を試みると共に、大型結晶化を行って、中性子回折実験を目指す。
また、SACLAを利用したⅩ線構造解析については、S-OH中間体からの構造の同期を如何にとるかが問題で、ビームラインに未だ装置開発の導入などが必要となるなど、実験は困難なことが予想される。しかし、常温で構造解析が実施できる点は動的解析に非常に有利で、他の手段の追随を許さないものと考え、引き続いてSACLAを用いた解析を進めながらS-OH中間体という生体中で発見された感応性化学種の同定と、そのダイナミズムを解明したいと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Redox-coupled structural changes in nitrite reductase revealed by serial femtosecond and microfocus crystallography (2016)
  • 著者名/発表者名: Yohta Fukuda, Tse Ka Man, Mamoru Susuki, Kay Diederichs, Kunio Hirata, Takanori Nakane, Michihiro Sugahara, Eriko Nango, Kensuke Tono, Yasumasa Joti, Takashi Kameshima, Changyong Song, Takaki Hatsui, Makina Yabashi, Osamu Nureki, Hiroyoshi Matsumura, Tsuyoshi Inoue, So Iwata, Eiichi Mizohata
  • 雑誌名: J. Biochem., 巻: 159（5） ページ: 527-538
  • DOI: doi: 10.1093/jb/mvv133.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Redox-coupled proton transfer mechanism in nitrite reductase revealed by femtosecond crystallography (2016)
  • 著者名/発表者名: Yohta Fukuda, Ka Man Tse, Tsuyoshi Inoue, So Iwata, Eiichi Mizohata et. el
  • 雑誌名: PNAS., 巻: 113（11） ページ: 2828-2933
  • DOI: 10.1073/pnas.1517770113
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Insights into unknown foreign ligand in copper nitrite reductase (2015)
  • 著者名/発表者名: Yohta Fukuda, Tse Ka Man, Yuji Kado, Eiichi Mizohata, Hiroyoshi Matsumura, Tsuyoshi Inoue
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun., 巻: 464（２） ページ: 622-628
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.07.025.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Epiregulin recognition mechanisms by anti-epiregulin antibody 9E5: Structural, functional and molecular dynamics simulation analyses (2015)
  • 著者名/発表者名: Yuji Kado, Eiichi Mizohata, Satoru Nagatoishi, Mariko Iijima, Keiko Shinoda, Takamitsu Miyafusa, Taisuke Nakayama, Takuma Yoshizumi, Akira Sugiyama, Takeshi Kawamura, Young-Hun Lee, Hiroyoshi Matsumura, Hirofumi Doi, Hideaki Fujitani, Tatsuhiko Kodama, Yoshikazu Shibasaki, Kouhei Tsumoto and Tsuyoshi Inoue
  • 雑誌名: J. Biol. Chem., 巻: 291 ページ: 2319-2330
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.656009
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structure-based design and synthesis of a bivalent iminobiotin analogue showing strong affinity toward a low immunogenic streptavidin mutant (2015)
  • 著者名/発表者名: Tatsuya Kawato, Eiichi Mizohata, Yohei Shimizu, Tomohiro Meshizuka, Tomohiro Yamamoto, Noriaki Takasu, Masahiro Matsuoka, Hiroyoshi Matsumura, Tatsuhiko Kodama, Motomu Kanai, Hirofumi Doi, Tsuyoshi Inoue, Akira Sugiyama
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 巻: 79（４） ページ: 640-642
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.991692.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり