生体酵素系に生成する感応性化学種の同定と機能解明

2016 年度 実績報告書

• 研究領域: 感応性化学種が拓く新物質科学
• 研究課題/領域番号: 24109017
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 井上 豪 大阪大学, 工学研究科, 教授 (20263204)
• 研究分担者: 中村 努 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 研究員 (10357668) ; 松村 浩由 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324809)
• 研究期間 (年度): 2012-06-28 – 2017-03-31
• キーワード: チオレドキシンペルオキシダーゼ / 還元反応 / 酵素反応 / 反応中間体 / Ⅹ線構造解析 / 中性子線解析 / Ⅹ線自由電子レーザー / SACLA

研究実績の概要

生体系では、酵素反応の過程で一過的に感応性化学種が生成し、特異な機能を発揮する場合がある。以前、超好熱性古細菌A. pernix K1由来ペルオキレドキシン（ApPrx）の反応中間体に超原子価硫黄原子種を含むS-OH中間体が活性種として存在することをⅩ線回折法を用いて明らかとしたが、超原子価のS原子上の水素原子の直接観測には至っていなかった。本研究課題では、S-OH中間体の詳細な構造を実験的に解析すると共に、その一般性を明らかとすることを目的とした。
超好熱性古細菌であるP. horikoshii (PhPrx)の結晶の、H2O2添加直後のⅩ線構造は、ApPrxと同様、S-OH中間体をとり、超原子硫黄の原子状態が広く一般的に生体内に存在することが判明した。また、S-OH中間体のS原子上の水素原子の直接観察のため、中性子回折法よる構造解析を目的とした大型結晶の作製に取り組んだ。2 mmを超える大型結晶が得られたものの、モザイク性も高く、3.5Å分解能のデータしか得られなかった。そこで、それぞれ10量体、12量体で存在するApPrxおよびPhPrxの結晶形を変更する目的で、会合体の境界面にアミノ酸の変異を導入した。ApPrxでは空間群がP1からP21に変わったものの、１軸が170.8Aと長くなり、国内の施設では中性子線回折のデータ収集が不可能であった。
そこで、12量体をとる超高熱古細菌T. kodakaraensis由来Prx(TkPrx)についても結晶化を行ったところ、空間群がP622に属する新たな結晶が得られ、現在、中性子線回折実験のための大型化に取り組んでいる。
一方、亜硝酸還元酵素NIRの変異体作製による人工酵素の作製を進め、別の酵素機能に酵素の骨格構造の構築には成功した。今後、SACLAにおけるX線自由電子レーザーを用いたこれら新しい機能も含めたNIRの時分割構造解析に取り組む予定である。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] A RuBisCO-mediated carbon metabolic pathway in methanogenic archaea. (2017)
  • 著者名/発表者名: Takunari Kono, Sandhya Mehrotra, Chikako Endo, Natsuko Kizu, Mami Matusda, Hiroyuki Kimura, Eiichi Mizohata, Tsuyoshi Inoue, Tomohisa Hasunuma, Akiho Yokota, Hiroyoshi Matsumura & Hiroki Ashida.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 8 ページ: 14007
  • DOI: doi:10.1038/ncomms14007
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Protein crystallization with paper (2016)
  • 著者名/発表者名: Miki Matsuoka, Keisuke Kakinouchi, Hiroaki Adachi, Mihoko Maruyama, Shigeru Sugiyama, Satoshi Sano, Hiroshi Y. Yoshikawa, Yoshinori Takahashi, Masashi Yoshimura, Hiroyoshi Matsumura, Satoshi Murakami, Tsuyoshi Inoue, Yusuke Mori and Kazufumi Takano
  • 雑誌名: Jpn. J. Appl. Phys., 巻: 55 ページ: 050302
  • DOI: http://iopscience.iop.org/1347-4065/55/5/050302
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Redox-coupled structural changes in nitrite reductase revealed by serial femtosecond and microfocus crystallography (2016)
  • 著者名/発表者名: Yohta Fukuda, Tse Ka Man, Mamoru Susuki, Kay Diederichs, Kunio Hirata, Takanori Nakane, Michihiro Sugahara, Eriko Nango, Kensuke Tono, Yasumasa Joti, Takashi Kameshima, Changyong Song, Takaki Hatsui, Makina Yabashi, Osamu Nureki, Hiroyoshi Matsumura, Tsuyoshi Inoue, So Iwata, Eiichi Mizohata
  • 雑誌名: J. Biochem., 巻: 159（5） ページ: 527-538
  • DOI: doi: 10.1093/jb/mvv133.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A crystallization technique for obtaining large protein crystals with increased mechanical stability using agarose gel combined with a stirring technique (2016)
  • 著者名/発表者名: Mihoko Maruyama, Yuki Hayashi, Hiroshi Y. Yoshikawa, Shino Okada, Haruhiko Koizumi, Masaru Tachibana, Shigeru Sugiyama, Hiroaki Adachi, Hiroyoshi Matsumura, Tsuyoshi Inoue, Kazufumi Takano, Satoshi Murakami, Masashi Yoshimura and Yusuke Mori
  • 雑誌名: J. Crystal Growth. 巻: 452 ページ: 172-178
  • DOI: http://doi.org/10.1016/j.jcrysgro.2015.11.008
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Promotion of protein crystal growth by actively switching crystal growth mode via femtosecond laser ablation (2016)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Tominaga, Mihoko Maruyama, Masashi Yoshimura, Haruhiko Koizumi, Masaru Tachibana, Shigeru Sugiyama, Hiroaki Adachi, Katsuo Tsukamoto, Hiroyoshi Matsumura, Kazufumi Takano, Satoshi Murakami, Tsuyoshi Inoue, Hiroshi Y. Yoshikawa and Yusuke Mori
  • 雑誌名: Nature Photonics., 巻: 10 ページ: 723-726
  • DOI: doi:10.1038/nphoton.2016.202
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] The molecular design of a mutant streptavidin with high specificity for only an artificial biotin derivative (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsuyoshi Inoue, Tatsuya Kawato, Eiichi Mizohata, Yohei Shimizu, Tomohiro Meshizuka, Tomohiro Yamamoto, Noriaki Takasu, Masahiro Matsuoka, Tatsuhiko Kodama, Motomu Kanai, Hirofumi Doi, Akira Sugiyama
  • 学会等名: 11th Pure and Applied Chemistry International Conference 2017 (PACCON 2017)
  • 発表場所: CENTRA GOVERNMENT COMPLEX HOTEL & CONVENTION CENTRE CHAENG WATTHANA, Bangkok
  • 年月日: 2017-02-02 – 2017-02-03
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structural Bioinorganic Chemistry of Copper Enzymes (2016)
  • 著者名/発表者名: Yohta Fukuda, Eiichi Mizohata, Tsuyoshi Inoue
  • 学会等名: The 4th International Symposium for Young Chemists on Stimuli-Responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules
  • 発表場所: 大阪大学吹田キャンパス 工学研究科 サントリーメモリアルホール（大阪府・吹田市）
  • 年月日: 2016-12-12 – 2016-12-13
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 中性子用大型良質タンパク質結晶育成を目指して (2016)
  • 著者名/発表者名: 安達宏昭、岡田詩乃、杉山成、丸山美帆子、高野和文、吉川洋史、村上聡、松村浩由、井上豪、森勇介
  • 学会等名: 日本結晶学会平成28年度年会
  • 発表場所: 茨城県立県民文化センター（茨城県・水戸市）
  • 年月日: 2016-11-17 – 2016-11-18
• [学会発表] SACLA が解明した銅含有亜硝酸還元酵素の常温無損傷構造 (2016)
  • 著者名/発表者名: 溝端 栄一
  • 学会等名: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [学会発表] エピレギュリン－抗体複合体構造解析に基づく分子認識機構の解明 (2016)
  • 著者名/発表者名: 門 祐示、溝端 栄一、長門石 曉、 飯嶋 真理子、篠田 恵子、宮房 孝光、 中山 泰亮、吉住 拓真、杉山 暁、 川村 猛、Lee Yougn-Hun、松村 浩由 、土居 洋文、児玉 龍彦、柴崎 芳一、津本 浩平、井上 豪
  • 学会等名: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [学会発表] 親和性向上を目的とした抗ROBO1 scFv の変異体解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 由井 杏奈、工藤 翔太、秋葉 宏樹、中木戸 誠、長門石 曉、井上 豪、浜窪 隆雄、津本 浩平
  • 学会等名: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • 年月日: 2016-06-07 – 2016-06-09