ユビキチンリガーゼによる選択的基質識別メカニズム

2015 年度 実績報告書

• 研究領域: ユビキチンネオバイオロジー：拡大するタンパク質制御システム
• 研究課題/領域番号: 24112006
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 嘉村 巧 名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (40333455)
• 研究分担者: 畠山 鎮次 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70294973)
• 研究期間 (年度): 2012-06-28 – 2017-03-31
• キーワード: タンパク質分解

研究実績の概要

ユビキチン修飾系は、時空間的選択性をもってタンパク質を識別し、ポリユビキチン鎖などの多様な様式のユビキチンを結合させることでタンパク質の機能を制御することにより、様々な生命現象に重要な働きを果たしている。中でも、基質特異性を決めるユビキチンリガーゼ(E3)の研究は、ユビキチン修飾系の中核をなす研究である。ユビキチンネオバイオロジーを理解するためには、ヒトに約600種存在するE3が時空間的選択性をもって識別する特異的基質の同定とその機能解明が不可欠である。本研究では、E3、中でもCullin型E3およびTRIM型E3に対する基質を分離・同定し、さらにはこれら酵素・基質関係により制御される生命現象を解明することを目的とする。DNAデータベースを利用しCullin型およびTRIM型E3の網羅的クローニングを行い、これらE3と相互作用する因子の同定を進めている。Cullin 型E3であるSSB4がシグナル伝達に、Zyg11Bが細胞死に、ASB12が細胞骨格に、ASB7が中心体複製に、さらにはPrameが転写に関与していることを見出しており、これらの細胞生物学的解析を進めている。
TRIM型E3に関しては、網羅的な生化学的解析により細胞分化やDNA修復に関与するTRIMタンパク質を同定しており、分子生物学的解析によりクロマチン制御に関する新たな機能が判明してきている。特に、TRIM23が脂肪細胞分化制御因子であるPPARを制御することで、脂肪細胞の分化成熟に関与することが明らかとなった。また、TRIM29がDNA修復因子群と相互作用し、DNA修復の足場として機能することが判明した。さらに、TRIM29は扁平上皮細胞に特異的に発現し、上皮細胞分化の制御因子であるp63やZEB1の発現調節に関与することが判明した。現在、TRIM29のクロマチン上で役割に関して詳細な機能解析を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

現在までに複数のE3に対する新規基質を明らかにし、その細胞生物学的意義の解析を行っていることより、本研究はおおむね順調に進展していると判断される。

今後の研究の推進方策

Cullin型およびTRIM型E3ユビキチンリガーゼに対する基質の網羅的解析
今までに引き続きCullin型およびTRIM型E3に対する基質の同定およびその機能解析を行う。①　Cullin型およびTRIM型E3との結合を指標とした基質の同定　DNAデータベースを利用しCullin型およびTRIM型E3を網羅的にクローニングし、免疫沈降法および質量分析法の組み合わせや酵母2ハイブリッド法により相互作用するタンパク質を同定し、内在性タンパク質レベルで新規基質候補タンパク質を確定する。②　機能的アッセイを用いたE3の新規基質候補タンパク質の絞り込み　野生型あるいは不活性型のE3の過剰発現あるいはRNA干渉法によるE3の発現コントロールを行い、新規基質候補の半減期への影響を検討する。この過程で同定した基質が分解に導かれるかどうかを選別ができる。試験管内あるいは培養細胞内でE3の新規基質へのユビキチン修飾能を検討する。③　E3による新規基質の制御の役割の細胞レベルでの検討　新規基質のアミノ酸配列よりその生体内での機能を予測する。E3の過剰発現あるいはRNA干渉法によりE3の発現を抑制した細胞株を作製し、酵素-基質対応から推測される機能に基づいて、細胞増殖アッセイ、細胞周期解析などを行う。④　E3による新規基質の制御の役割の個体レベル、遺伝学的検討　E3のトランスジェニックマウスやノックアウトマウスを作製し、発生や病理学的検索を行うと共に、③の結果より推測される現象に関して検討する。また、神経・心筋・線維芽細胞などの初代培養細胞を調製し、新規基質の発現量およびユビキチン化の有無を調べる。これらの初代培養細胞を用いて③で観察された現象を中心に解析する。⑤　構造生物学的解析　計画研究08水島らと共同でE3-基質の結晶構造解析を行う。

研究成果

• [雑誌論文] The role of cullin 5-containing ubiquitin ligases. (2016)
  • 著者名/発表者名: Okumura, F., Okumura, AJ., Nakatsukasa, K., Kamura, T
  • 雑誌名: Cell Division 巻: 11 ページ: 1
  • DOI: 10.1186/s13008-016-0016-3
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Subcellular Fractionation Analysis of the Extraction of Ubiquitinated Polytopic Membrane Substrate during ER-Associated Degradation (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakatsukasa, K., Kamura, T
  • 雑誌名: Plos one 巻: 11 ページ: e0148327
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0148327
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Early evidence for the role of TRIM29 in multiple cancer models. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hatakeyama, S
  • 雑誌名: Expert Opin. Ther. Targets 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] TRIM39 negatively regulates the NFkB-mediated signaling pathway through stabilization of cactin. (2016)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, M., Watanabe, M., Nakamaru, Y., Takagi, D., Takahashi, H., Fukuda, S. and Hatakeyama, S
  • 雑誌名: Cell. Mol. Life Sci. 巻: 73 ページ: 1085-1101
  • DOI: 10.1007/s00018-015-2040-x.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The ubiquitin ligase SCFUcc1 acts as a metabolic switch for the glyoxylate cycle. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakatsukasa, K., Nishimura, T., Byrne, D., Okamoto, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Chibana, H., Okumura, F., Kamura, T
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 59 ページ: 22-34
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2015.04.013
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Proteolytic regulation of metabolic enzymes by E3 ubiquitin ligase complexes: lessons from yeast. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakatsukasa, K., Okumura, F., Kamura, T
  • 雑誌名: Crit Rev Biochem Mol Biol. 巻: 50 ページ: 489-502
  • DOI: 10.3109/10409238.2015.1081869
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] he TRIM-FLMN protein TRIM45 directly interacts with RACK1 and negatively regulates PKC-mediated signaling pathway. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sato, T., Takahashi, H., Hatakeyama, S., Iguchi, A. and Ariga, T.
  • 雑誌名: Oncogene 巻: 34 ページ: 1280-1291
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.01.011
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Molecular role of RNF43 in canonical and noncanonical Wnt signaling (2015)
  • 著者名/発表者名: Tsukiyama, T., Fukui, A., Terai, S., Fujioka, Y., Shinada, K., Takahashi, H., Yamaguchi, T.P., Ohba, Y., and Hatakeyama, S.
  • 雑誌名: Mol. Cell. Biol. 巻: 35 ページ: 2007-2023
  • DOI: 10.1128/MCB.00159-15
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The E3 ubiquitin ligase TRIM23 regulates adipocyte differentiation via stabilization of the adipocyte activator PPAR gamma. (2015)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, M., Takahashi, H., Saeki, Y., Ozaki, T., Itoh, S., Suzuki, M., Mizushima, W., Tanaka, K. and Hatakeyama, S.
  • 雑誌名: eLIFE 巻: 4 ページ: e05615
  • DOI: 10.7554/eLife.05615
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] TRIM29 regulates the assembly of DNA repair proteins into damaged chromatin. (2015)
  • 著者名/発表者名: Masuda, Y., Takahashi, H., Sato, S., Tomonori-Sato, C., Saraf, A., Washburn, M.P., Florens, L., Conaway, R.C., Conaway, J.W. and Hatakeyama, S.
  • 雑誌名: Nature Commun. 巻: 6 ページ: 7299
  • DOI: 10.1038/ncomms8299
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] TRIM29 regulates the p63-mediated pathway in cervical cancer cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Masuda, Y., Takahashi, H. and Hatakeyama, S.
  • 雑誌名: Biochim. Biophy. Acta-Mol. Cell Res 巻: 1853 ページ: 2296-2305
  • DOI: 10.1016/j.bbamcr.2015.05.035
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Fボックスタンパク質Ucc1による代謝制御機構の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 中務 邦雄、嘉村 巧
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
  • 招待講演
• [学会発表] TRIMファミリーユビキチンリガーゼによる生体制御機構 (2015)
  • 著者名/発表者名: 畠山鎮次
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
  • 招待講演
• [学会発表] pVHL依存的なFOBとHIFαの分解はそれぞれ独立してVHL病を制御している (2015)
  • 著者名/発表者名: 奥村 文彦、植松 桂司、Stuart D. Byrne、平野 みえ、奥村(城尾) 晶子、錦見 昭彦、執印 太郎、福井 宣規、中務 邦雄、嘉村 巧
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 染色体安定性の維持におけるCRL5ASB7ユビキチンリガーゼの機能 (2015)
  • 著者名/発表者名: 植松 桂司、奥村 文彦、中務 邦雄、嘉村 巧
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] ユビキチンリガーゼSCFMet30の新規基質p17の同定と機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 富澤 優貴、中務 邦雄、奥村 文彦、嘉村 巧
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 出芽酵母E3リガーゼSCFDia2の新奇基質Prl1の同定 (2015)
  • 著者名/発表者名: Dawit Hailu Alemayehu、中務 邦雄、奥村 文彦、嘉村 巧
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] Hect型E3リガーゼTom1によるFEARネットワーク構成因子Spol2の分解制御 (2015)
  • 著者名/発表者名: 栗田 英奈、中務 邦雄、曽根 恵、奥村 文彦、嘉村 巧
  • 学会等名: BMB2015
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [備考] 分子修飾学教室へようこそ
  • URL: http://bunshi4.bio.nagoya-u.ac.jp/~2kamura/index.html