選択的なポリユビキチン鎖検出・定量法の開発

2016 年度 実績報告書

• 研究領域: ユビキチンネオバイオロジー：拡大するタンパク質制御システム
• 研究課題/領域番号: 24112008
• 研究機関: 公益財団法人東京都医学総合研究所
• 研究代表者: 佐伯 泰 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 副参事研究員 (80462779)
• 研究期間 (年度): 2012-06-28 – 2017-03-31
• キーワード: ユビキチン / プロテアソーム / タンパク質分解 / 質量分析計 / 定量プロテオミクス / アフィニティープローブ

研究実績の概要

ユビキチンシグナルの全貌解明を目的とし、以下の研究を推進した。
1．質量分析によるユビキチン鎖の識別定量法の確立：これまでPRM法により、全てのユビキチンリンケージを超微量（100 amol）から絶対定量する系を確立し、領域内で見出された重要な基質のユビキチン鎖情報を得てきた。本年度はヒストンH3に付加されるユビキチン修飾、リボソームに付加されるユビキチン修飾等の解析に成功した。一方、領域内で見出されたK48/K63分岐型ユビキチン鎖の絶対定量系開発を共同で実施した。
2．ユビキチン結合タンパク質の網羅的解析：ユビキチン修飾系のデコーダー分子であるユビキチン結合タンパク質が細胞内で相互作用するユビキチン鎖を網羅的に定量解析することで、細胞内のユビキチンシグナルの使い分けを明らかにした。その結果、プロテアソームによるユビキチン化タンパク質の分解経路は、細胞内ではCdc48/p97とRad23を経由する間接的経路が主要であり、プロテアソーム分解のK48鎖選択性はCdc48のコファクターNpl4に依ることを明らかにした。
3．ホルマリン固定サンプルを用いた質量分析解析：ユビキチン結合タンパク質とユビキチン鎖、ユビキチンリガーゼと基質タンパク質、プロテアソームとその制御因子の相互作用は可逆的であり、従来の免疫沈降法では相互作用が失われてしまうことが多い。そこで、細胞を低濃度ホルマリンにより固定し、免疫沈降・質量分析解析に供す系を開発した。その結果、0.5～1％のホルマリン固定条件では3xFLAGタグによる免疫沈降が可能であり、基質タンパク質をbaitとしたユビキチンリガーゼの同定、プロテアソームをbaitとした結合タンパク質の同定、そしてユビキチン結合タンパク質をbaitとしたユビキチン鎖の絶対定量に成功した。よって、本方法はユビキチン研究をさらに進展させることが可能である。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] In Vivo Ubiquitin Linkage-type Analysis Reveals that the Cdc48-Rad23/Dsk2 Axis Contributes to K48-linked Chain Specificity of the Proteasome. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsuchiya, H., Ohtake, F., Arai, N., Kaiho, A., Yasuda, S., Tanaka, K., and Saeki, Y.
  • 雑誌名: Mol Cell 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Ubiquitin recognition by the proteasome. (2017)
  • 著者名/発表者名: Saeki, Y.
  • 雑誌名: J. Biochem. 巻: 161 ページ: 113-124
  • DOI: 10.1093/jb/mvw091.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Ankrd13 Family of Ubiquitin-interacting Motif-bearing Proteins Regulates VCP/p97-mediated Lysosomal Traffic of Caveolin-1. (2016)
  • 著者名/発表者名: Burana, D., Yoshihara, H., Tanno, H., Yamamoto, A., Saeki, Y., Tanaka, K., and Komada, M.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 291 ページ: 6218-6231
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.710707
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The K48-K63 branched ubiquitin chain regulates NF-kappaB signaling. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ohtake, F., Saeki, Y., Ishido, S., Kanno, J., and Tanaka, K.
  • 雑誌名: Mol Cell 巻: 64 ページ: 251-266
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2016.09.014.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] HTLV-1 Tax Induces Formation of the Active Macromolecular IKK Complex by Generating Lys63- and Met1-Linked Hybrid Polyubiquitin Chains. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shibata, Y., Tokunaga, F., Goto, E., Komatsu, G., Gohda, J., Saeki, Y., Tanaka, K., Takahashi, H., Sawasaki, T., Inoue, S., Oshiumi, H., Seya, T., Nakano, H., Tanaka, Y., Iwai, K., and Inoue, J-I.
  • 雑誌名: PLoS Pathog. 巻: 13 ページ: e1006162
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1006162
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 分子標的薬「プロテアソーム阻害剤」 (2016)
  • 著者名/発表者名: 佐伯 泰
  • 雑誌名: 腎臓内科・泌尿器科 巻: 4 ページ: 30-38
• [学会発表] Cdc48/p97-Rad23軸がプロテアソーム分解の主要経路である (2016)
  • 著者名/発表者名: 佐伯 泰
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-12-01 – 2016-12-01
  • 招待講演
• [学会発表] ユビキチン修飾の全容解明を目指して：Parallel Reaction Monitoring法によるユビキチン鎖の超高感度絶対定量法の開発と応用 (2016)
  • 著者名/発表者名: 佐伯 泰、土屋 光、大竹史明、田中啓二
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2016年大会
  • 発表場所: 北里大学（東京都港区）
  • 年月日: 2016-07-29 – 2016-07-29
  • 招待講演
• [備考] 公益財団法人東京都医学総合研究所蛋白質代謝研究室ホームページ
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/pro-meta/
• [備考] ライフサイエンス新着論文レビュー「K48/K63分岐型のユビキチン鎖はNF-κBシグナルを制御する」
  • URL: http://first.lifesciencedb.jp/archives/14798