計画研究
植物細胞壁の主成分である結晶性セルロースが，セルラーゼによってどのように分解されるのかを明らかにするために，高速原子間力顕微鏡（HS-AFM）および全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて観察を行った。これら一分子観察によって植物細胞壁のような固体表面で分解酵素はどのように振る舞うのかを明らかにし，植物細胞壁と分解酵素を動的に可視化することに成功した。結晶性セルロース表面に吸着した酵素の滞在時間を測定し，その頻度分布のヒストグラムを解析したところ，二重指数関数で近似されることが明らかとなった。本結果は米国生化学会誌（J. Biol. Chem.）に受理された。また，連続的（プロセッシブ）な加水分解速度が異なると考えられる3つのセロビオヒドロラーゼ（TrCel7A，PcCel7C，PcCel7D）の加水分解速度と解離定数の関係を明らかにするために，高速原子間力顕微鏡によって三つの酵素の挙動を明らかにした。その結果加水分解速度と表面からの解離にはトレードオフの関係が成り立つことが分かった。本結果は米国化学会誌（J. Amer. Chem. Soc.）に受理された。さらに、セルロース生合成酵素（GxCeSAB）の異宿主発現系の構築を試み，メタノール資化性酵母を用いた発現系の構築に成功した。GxCeSABによるin vitroセルロース合成反応の結果，白色の水不溶性物質の生成が確認された。生成物をTricoderma reesei由来のセルラーゼ（TrCel7A）によって分解した結果，白色の水不溶性物質は完全に無くなり，分解物としてグルコースとセロビオースが生じることを確認した。以上の結果は，Pichia酵母を用いたセルロース合成酵素の生産に成功し，さらにin vitroでのセルロース合成に成功したことを示しており，投稿に向けて準備中である。
2: おおむね順調に進展している
セルラーゼを用いた植物細胞壁分解プロセスの可視化に関しては、予想以上の進展を見せており、いくつもの公表論文となっている点は当初の計画以上であると思われるが、その一方でセルロース合成酵素の発現に関しては、異宿主（Pichia pastoris）を用いた発現系の構築までは予想以上の進度であったが、発現タンパク質量の生産性が分解酵素と比較して極端に低く、そのために今年度の進展は年度初めに考えたいたほどではなかった。昨年度の進展を含めると全体としては遅れていないことから「おおむね順調に進展している」との評価をした。
当初の計画項目である①植物細胞壁成分の自己組織化，②植物細胞壁分解酵素の基質認識を利用した細胞壁の動的可視化に関する研究は引き続き当初の計画通り遂行していく。さらに平成25年度までの研究を展開する過程で，③メタノール資化性酵母P. pastorisを用いた植物由来タンパク質の異宿主発現系の構築が，本プロジェクトの他の研究チームに多大な貢献となることが明らかとなったことから，本手法のプロトコルを共有していく。さらに，上述のように植物感染性糸状菌などの細胞壁の主成分であるキチンの分解に関しても動的に可視化できることが明らかになってきており，④様々な細胞壁成分分解酵素の動的可視化に関しても，本領域の研究を推進する上で重要な成果が期待できることが判明した。そこで，上記二つの当初計画の課題に加え，次年度以降は，更に二つの解析を研究目標にし，合計４項目について研究を推進する予定である。
すべて 2015 2014 その他
すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 5件) 備考 (1件)
J. Amer. Chem. Soc.
巻: 136 ページ: 4584-4592
10.1021/ja4119994
J. Biol. Chem.
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Biochem. Biophys. Res. Commun.
巻: 452 ページ: 520-525
10.1016/j.bbrc.2014.08.103
http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2014/20140313-4.html
