プラス鎖ＲＮＡウイルスの複製におけるウイルスと宿主の攻防

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: ウイルス感染現象における宿主細胞コンピテンシーの分子基盤
• 研究課題/領域番号: 24115003
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 脇田 隆字 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 部長 (40280789)
• 研究分担者: 竹安 邦夫 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (40135695)
• 研究期間 (年度): 2012-06-28 – 2017-03-31
• キーワード: プラス鎖RNAウイルス / HCV / 宿主 / 原子間力顕微鏡

研究概要

HCVなどのプラス鎖RNAウイルスはウイルスゲノムが短く、コードされるウイルス遺伝子数は限られており、ウイルス複製増殖や病原性発現には、ウイルスタンパク質が多機能を有するとともに、多くの宿主因子を動員する必要がある。従って、HCVは、感染体と宿主の攻防を研究するために適したモデルである。網羅的な手法で見出した宿主因子について、ウイルス複製、粒子形成、成熟化における役割について解析していく。NS5A発現細胞からNS5Aに結合する膜蛋白を精製し, プロテオーム解析、およびsiRNA screeningを行ったところ、翻訳および複製過程に関与している蛋白としてELVL1を見出した。ELVL1はHCV RNA、NS3およびNS5蛋白質と結合して、HCV RNAの翻訳と複製に関与していることが明らかとなった。ELVL1の共生発現によりHCV RNAのnuclease感受性が高まることから、ELVL1がHCV RNAの細胞内局在を制御していることが推測された。さらに“RNAを見る”ための技術開発を行った。原子間力顕微鏡下で1本鎖RNAを可視化するために、スペルミジンでコートした雲母片を基板に用いて、９Kbの1本鎖HCV RNAの構造解析を行った。AFM解析で求めたRNAの体積は塩基長に比例することから、体積測定がRNAを特定することと、特定の分子内ループの存在はAFM画像から検出できることが分かった。一方、藤田班との共同で2本鎖RNAのインターフェロン産生に必須なMDA5は、二本鎖RNAへの結合とATPase活性に依存して構造を球状に変化させること、MDA5の変異体では、RNA非存在下でも球状構造を示すことが分かった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

HCVの複製および翻訳に重要な宿主因子を同定し、さらにその宿主因子がHCVの複製にかかわる分子機構を明らかにしてきている。また、“RNAを見る”ための技術上の問題点を克服し、技術を現実的なものとした。これまで可視化できなかった個別のウイルスゲノム構造を可視化した。この技術の応用により、ウイルスゲノムと宿主因子の相関を分子単位レベルで観察可能となることが期待できる。これまでの研究内容をすでに複数の論文として報告した。

今後の研究の推進方策

HCVの複製の場としての細胞内微細構造である、二重膜ベジクル形成が重要と考えられる。感染細胞における二重膜ベジクル形成機構とウイルスおよび宿主蛋白質の関係を解析する。そのために分子生物学および細胞生物学的解析を電子顕微鏡と組み合わせて解析を進める。また、感染体ゲノム-タンパク質複合体のナノメートルレベルの構造および感染体ゲノムの細胞内動態についても、HCVウイルス、インフルエンザウイルスを始めとする領域内の多様なウイルス種も対象として解析を行う。AFMによるウイルスゲノムと宿主因子の相関についても解析を進める。

研究成果

• [雑誌論文] Hepatitis virus infection affects DNA methylation in mice with humanized livers (2014)
  • 著者名/発表者名: Okamoto Y, Shinjo K, Shimizu Y, Sano T, Yamao K, Gao W, Fujii M, Osada H, Sekido Y, Murakami S, Tanaka Y, Joh T, Sato S, Takahashi S, Wakita T, Zhu J, Issa JP, Kondo Y
  • 雑誌名: Gastroenterology 巻: 146 ページ: 562-572
  • DOI: 10.1053/j.gastro.2013.10.056
  • 査読あり
• [雑誌論文] Production of single-round infectious chimeric flaviviruses with DNA-based Japanese encephalitis virus replicon (2014)
  • 著者名/発表者名: Suzuki R, Ishikawa T, Konishi E, Matsuda M, Watashi K, Aizaki H, Takasaki T, Wakita T
  • 雑誌名: J Gen Virol 巻: 95 ページ: 60-65
  • DOI: 10.1099/vir.0.058008-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] HCV NS3 protease enhances liver fibrosis via binding to and activating TGF-β type I receptor (2013)
  • 著者名/発表者名: Sakata K, Hara M, Terada T, Watanabe N, Takaya D, Yaguchi S, Matsumoto T, Matsuura T, Shirouzu M, Yokoyama S, Yamaguchi T, Miyazawa K, Aizaki H, Suzuki T, Wakita T, Imoto M, Kojima S
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 22 ページ: 3243
  • DOI: 10.1038/srep03243
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enterovirus 71 Binding to PSGL-1 on Leukocytes: VP1-145 Acts as a Molecular Switch to Control Receptor Interaction (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishimura Y, Lee H, Hafenstein S, Kataoka C, Wakita T, Bergelson JM, Shimizu H
  • 雑誌名: PLoS Pathogen 巻: 9 ページ: e1003511
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1003511
  • 査読あり
• [雑誌論文] Signal Peptidase Complex Subunit 1 Participates in the Assembly of Hepatitis C Virus through an Interaction with E2 and NS2 (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki R, Matsuda M, Watashi K, Aizaki H, Matsuura Y, Wakita T, Suzuki T
  • 雑誌名: PLoS Pathogen 巻: 9 ページ: e1003589
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1003589
  • 査読あり
• [雑誌論文] Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase AID (2013)
  • 著者名/発表者名: Watashi K, Liang G, Iwamoto M, Marusawa H, Uchida N, Daito T, Kitamura K, Muramatsu M, Ohashi H, Kiyohara T, Suzuki R, Li J, Tong S, Tanaka Y, Murata K, Aizaki H, Wakita T
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 288 ページ: 31715-31727
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.501122
  • 査読あり
• [雑誌論文] A class II phosphoinositide 3-kinase plays an indispensable role in hepatitis C virus replication (2013)
  • 著者名/発表者名: Maehama T, Fukasawa M, Date T, Wakita T, Hanada K
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 440 ページ: 150-156
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.09.048
  • 査読あり
• [雑誌論文] Specific inhibition of hepatitis C virus entry into host hepatocytes by fungi-derived sulochrin and its derivatives (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakajima S, Watashi K, Kamisuki S, Tsukuda S, Takemoto K, Matsuda M, Suzuki R, Aizaki H, Sugawara F, Wakita T
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 440 ページ: 515-520
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.09.100
  • 査読あり
• [雑誌論文] The hepatitis E virus capsid C-terminal region is essential for the viral life cycle: implication for viral genome encapsidation and particle stabilization (2013)
  • 著者名/発表者名: Shiota T, Li TC, Yoshizaki S, Kato T, Wakita T, Ishii K
  • 雑誌名: J Virol. 巻: 87(10): ページ: 6031-6036
  • DOI: 10.1128/JVI.00444-13
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oxysterol-binding protein family I is the target of minor enviroxime-like compounds (2013)
  • 著者名/発表者名: Arita M, Kojima H, Nagano T, Okabe T, Wakita T, Shimizu H
  • 雑誌名: J Virol 巻: 87 ページ: 4252-4260
  • DOI: 10.1128/JVI.03546-12
  • 査読あり
• [雑誌論文] Thromboxane A2 Synthase Inhibitors Prevent Production of Infectious Hepatitis C Virus in Mice with Humanized Livers (2013)
  • 著者名/発表者名: Abe Y, Aly HH, Hiraga N, Imamura M, Wakita T, Shimotohno K, Chayama K, Hijikata M
  • 雑誌名: Gastroenterology 巻: 145 ページ: 658-667
  • DOI: 10.1053/j.gastro.2013.05.014
  • 査読あり
• [雑誌論文] Antiviral Activity of Glycyrrhizin against Hepatitis C Virus In Vitro (2013)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto Y, Matsuura T, Aoyagi H, Matsuda M, Hmwe SS, Date T, Watanabe N, Watashi K, Suzuki R, Ichinose S, Wake K, Suzuki T, Miyamura T, Wakita T, Aizaki H
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e68992
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0068992
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neutralizing antibodies induced by cell culture-derived hepatitis C virus protect against infection in mice (2013)
  • 著者名/発表者名: Akazawa D, Moriyama M, Yokokawa H, Omi N, Watanabe N, Date T, Morikawa K, Aizaki H, Ishii K, Kato T, Mochizuki H, Nakamura N, Wakita T
  • 雑誌名: Gastroenterology 巻: 145 ページ: 447-455
  • DOI: 10.1053/j.gastro.2013.05.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] Human G-proteins, ObgH1 and Mtg1, associate with the large mitochondrial ribosome subunit and are involved in translation and assembly of respiratory complexes (2013)
  • 著者名/発表者名: Kotani T, Akabane S, Takeyasu K, Ueda T, Takeuchi N
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res. 巻: 41 ページ: 3713-3722
  • DOI: 10.1093/nar/gkt079
  • 査読あり
• [雑誌論文] Visualization of structural changes accompanying activation of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors using fast-scan atomic force microscopy imaging (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Y, Goetze TA, Stroebel D, Balasuriya D, Yoshimura SH, Henderson RM, Paoletti P, Takeyasu K, Edwardson JM
  • 雑誌名: J. Biol. Chem 巻: 288 ページ: 778-784
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.422311
  • 査読あり
• [雑誌論文] Intermolecular disulfide bonds among nucleoporins regulate karyopherin-dependent nuclear transport (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshimura SH, Otsuka S, Kumeta M, Taga M, Takeyasu K
  • 雑誌名: J. Cell Sci. 巻: 126 ページ: 3141-3150
  • DOI: 10.1242/jcs.124172
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nucleolar scaffold protein, WDR46, determines the granular compartmental localization of nucleolin and DDX21 (2013)
  • 著者名/発表者名: Hirai Y, Louvet E, Oda T, Kumeta M, Watanabe Y, Horigome T, Takeyasu K
  • 雑誌名: Genes Cells 巻: 18 ページ: 780-797
  • DOI: 10.1111/gtc.12077
  • 査読あり
• [雑誌論文] An alternative beads-on-a-string chromatin architecture in Thermococcus kodakarensis (2013)
  • 著者名/発表者名: Maruyama H, Harwood JC, Moore KM, Paszkiewicz K, Durley SC, Fukushima H, Atomi H, Takeyasu K, Kent NA
  • 雑誌名: EMBO Rep. 巻: 14 ページ: 711-717
  • DOI: 10.1038/embor.2013.94
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bacillus subtilis DprA recruits RecA onto ssDNA and mediates annealing of complementary ssDNA strands coated by SsbB and SsbA (2013)
  • 著者名/発表者名: Yadav T, Carrasco B, Hejna J, Suzuki Y, Takeyasu K, Alonso JC
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288 ページ: 22437-22450
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.478347
  • 査読あり
• [雑誌論文] Early steps of double-strand break repair in Bacillus subtilis (2013)
  • 著者名/発表者名: Alonso JC, Cardenas PP, Sanchez H, Hejna J, Suzuki Y, Takeyasu K
  • 雑誌名: DNA Repair 巻: 12 ページ: 162-176
  • DOI: 10.1016/j.dnarep.2012.12.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] AFM investigation of the organization of actin bundles formed by actin-binding proteins (2013)
  • 著者名/発表者名: Gilmore JL, Kumeta M, Takeyasu K
  • 雑誌名: Journal of Surface Engineered Materials and Advanced Technology (JSEMAT) 巻: 3 ページ: 13-19
  • DOI: 10.1111/gtc.12131
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-speed atomic force microscopy combined with inverted optical microscopy for studying cellular events (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Y, Sakai N, Yoshida A, Uekusa Y, Yagi A, Imaoka Y, Ito S, Karaki K, Takeyasu K
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 3 ページ: 2131
  • DOI: 10.1038/srep02131.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Antibody-based analysis reveals "filamentous vs. non-filamentous" and "cytoplasmic vs. nuclear" crosstalk of cytoskeletal proteins (2013)
  • 著者名/発表者名: Kumeta M, Hirai Y, Yoshimura SH, Horigome T, Takeyasu K
  • 雑誌名: Exp. Cell Res. 巻: 319 ページ: 3226-3237
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2013.07.021
  • 査読あり
• [学会発表] C型肝炎ウイルスNS5A結合膜蛋白ELAVL1のウイルス複製・翻訳スイッチング機構の解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 後藤耕司, 相崎英樹, 渡邉則幸, 渡士幸一, 鈴木亮介, 山越智, 四柳宏, 森屋恭爾, 小池和彦, 鈴木哲朗, 宮村達男, 脇田隆字
  • 学会等名: 第61回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 神戸国際会議場
  • 年月日: 20131110-20131112
• [学会発表] Infectious Genotype 3a Hepatitis C Virus in Cell Culture (2013)
  • 著者名/発表者名: S Kim, T Date, H Yokokawa, T Kono, H Aizaki, C Gondeau, P Maurel, T Wakita
  • 学会等名: 20th International Meeting on Hepatitis C and Related Viruses
  • 発表場所: Melbourne Convention and Exhibition Centre, Melbourne, Australia
  • 年月日: 20131006-20131010
• [学会発表] Hepatitis C virus cell culture system and antiviral development (2013)
  • 著者名/発表者名: T Wakita
  • 学会等名: 17th International Symposium on the Cells of the Hepatic Sinusoid
  • 発表場所: Osaka International Convention Center, Osaka, Japan
  • 年月日: 20130923-20130925
  • 招待講演
• [学会発表] Hepatitis C virus RNA replication in human stellate cells regulates gene expression of extracellular matrix-related molecules (2013)
  • 著者名/発表者名: H Aizaki, N Watanabe, H Aoyagi, K Watashi, R Suzuki, S Kojima, T Matsuura, K Wake, T Suzuki, T Wakita
  • 学会等名: 17th International Symposium on the Cells of the Hepatic Sinusoid
  • 発表場所: Osaka International Convention Center, Osaka, Japan
  • 年月日: 20130923-20130925
• [学会発表] Molecular Biology and Experimental Models of HCV (2013)
  • 著者名/発表者名: T Wakita
  • 学会等名: 19th Annual KASL Meeting
  • 発表場所: Sheraton Grande Walkerhill Hotel, Seoul, Korea
  • 年月日: 20130613-20130615
  • 招待講演