| 研究領域 | 運動超分子マシナリーが織りなす調和と多様性 |
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| 研究課題/領域番号 |
24117002
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
宮田 真人 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (50209912)
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| 研究分担者 |
西坂 崇之 学習院大学, 理学部, 教授 (40359112) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| キーワード | 細胞運動 / 一分子計測 / 電子顕微鏡 / 構造生物学 / 微生物 / 寄生細菌 / 電子線クライオトモグラフィー / 遺伝子操作 |
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| 研究実績の概要 |
淡水魚の病原細菌，Mycoplasma mobile（モービレ）はその片側に滑走装置を形成し，ユニークなメカニズムで‘滑走運動’する．本研究ではこれまでの実験結果から提案した運動メカニズムの作業仮説，「滑走装置は4種類の新規巨大タンパク質から成る表面構造と，7種類のタンパク質から成る内部構造に分けられる．滑走装置からは長さ50ナノメートルのやわらかいあしが多数つきだしている．ATPの加水分解により装置に動きが生じ，あしのタンパク質が宿主細胞表面などのシアル酸オリゴ糖をつかんだり，ひっぱったり，はなしたりして，滑走運動が起こる．」に沿った実験を行い，マイコプラズマの滑走運動を，‘従来型モータータンパク質’と同レベルにまで解明することを目標としている．また，モービレと同じモリクテス綱に属するヒト病原細菌，Mycoplasma pneumoniae（ニューモニエ）は同様に滑走運動を行うが，必須タンパク質などにモービレとの共通性はない．モリクテス綱に属する上海ガニ病原菌，Spiroplasma eriocheiris（エリオケイリス）はらせん方向を先端から後端へ向けて繰り返し反転することで，高粘度溶液中を遊泳する．本研究では，これら3種類の運動能について研究段階に合わせて (1) 運動に必須なタンパク質の特定，(2) 運動に必須なタンパク質の構造解析，(3) 運動装置の構造解析，(4) 運動装置における動きや力の検出と解析，を行い次項に記載する結果を得た．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Mycoplasma mobile：菌体内部にある滑走のモーターを単離し，クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析により15オングストロームの解像度で三次元構造を明らかにした．その結果，ATP合成酵素から進化した滑走モーターが二量体を形成し，さらにその二量体が連結して細胞膜直下の格子構造になっていることが示された．格子構造には，新奇のフレーム構造や，動きを外部へ伝えると思われるアーム構造が含まれていた．格子構造を構成すると考えられるタンパク質の大まかな局在位置を，蛍光顕微鏡観察により示した．滑走装置表面に存在するあしに関しては，急速凍結レプリカ電子顕微鏡法により，滑走時における形状をとらえることに成功し，また，プラスチックビーズを，ガラス表面に固定した菌につかませることで，1本の動きを直接観察することに成功した．さらに遊離のシアル酸オリゴ糖を加えて働くあしの数を減らすことで，1本のあしの出す力が一般的なモータータンパク質の数分の1であることを突き止めた．
Mycoplasma pneumoniae：MNP387とP65の二つのタンパク質の構造と滑走装置内部構造における存在位置を明らかにした．滑走のあしとして働くP1 adhesinの構造を，クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析により，9オングストロームの解像度で明らかにした．またP1 adhesin複合体の単離に成功した．
Spiroplasma eriocheiris：二成分制御系ではない化学走性メカニズムを持つことを示した．単離した遊泳装置の解析から，遊泳方向先端部にロッド状の新規構造が存在すること，構成タンパク質にアクチンオルソログであるMreBが4種類含まれていることなどを明らかにした．らせんピッチの詳細な解析により，らせん反転の力が前方から後方に伝搬していることを示唆した．遺伝子操作の系を立ち上げることに成功した．
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度の翌年であることを踏まえ，現在までの進捗状況にあげたそれぞれの項目を以下の様に完成させる．
Mycoplasma mobile：菌体内部にある滑走のモーターの単離方法，三次元構造を計算する方法に工夫を行うことで，より高解像度で不明瞭部分の少ない全体像を得る．カギとなるタンパク質の結晶化を行い，原子レベルの像を得る．急速凍結レプリカ電子顕微鏡法により，滑走時におけるあしの構造変化をとらえる．
Mycoplasma pneumoniae：P1 adhesinとその複合体の構造を，クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析により，高解像度で明らかにする．
Spiroplasma eriocheiris：運動の装置を構成するタンパク質の局在とその変化を，蛍光タンパク質融合により明らかにする．遊泳におけるMreBの役割を阻害剤A22の影響から議論する．遊泳装置の繊維状部分を構成するタンパク質Fib, MreB1, MreB2, MreB3, MreB4について重合能と構造について調べる．
これらの結果を加えて，6年間の成果全てを出版する．
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