計画研究
細菌のタンパク質膜透過を媒介する２つの分子モーター (SecA ATPase, SecDF) の駆動メカニズムを解明するために、研究代表者らは部位特異的in vivo光架橋法を用いて解析を進めている。これは、生細胞中での一過的な相互作用を高い空間分解能で明らかにすることが出来る画期的な手法であり、これまでに、SecA ATPase-SecY間の近接部位の同定などに成果を上げてきた。本年は、この手法をPMFを利用して膜透過を促進するSecDF分子に適応し、基質タンパク質分子と相互作用する領域の同定に成功した。更には、SecD-SecF間の相互作用様式が、プロトンの細胞内流入と共役して変化する事を示唆するデータを得た。これらの成果は、我々が提唱しているSecDFによる膜透過昂進の作業仮説を支持する。加えて、SecD機能発現に重要な役割を持つアミノ酸残基の同定にも成功した。この部位の機能解析を進める事で、SecDFの駆動メカニズムの解明に繋がるものと期待される。本研究課題と密接に関連して、我々は、膜タンパク質の膜組み込み反応に関わる因子YidCの研究も進めている。本年は、YidCの基質結合部位に関して新たな知見を得た。奈良先端技術科学大学の塚崎智也博士らとの共同研究により、このタンパク質の立体構造を明らかにあすると共に、基質タンパク質との相互作用に関与すると考えられる親水性の溝の存在を見い出した。そこで、実際にこの部位が基質との相互作用に関わるかどうかを、上記手法を用いて確認し、実際にこの溝が基質膜タンパク質と近接している事を示す結果を得た。本成果は、Nature紙に掲載され国際的にも高い評価を得ている。
2: おおむね順調に進展している
本研究の主要な目的は、SecYEGとSecDFとの近接部位を明らかにする事であるが、現在の所この点に関しては充分な成果は得られていない。細胞内の相互作用因子の量の不均一性の可能性を考慮し、昨年度はplasmidからSecYEGの発現を促すなど実験手法の改良を試み検討したが、思惑通りの成果は得られなかった。相互作用部位が膜内に位置しており、現在の架橋反応が適当でない可能性が考えられる。光反応性アミノ酸アナログの種類を変更する等、別のアプローチの必要性を感じている。（今後の推進方策に対策を記載）その一方で、SecDF分子内の基質タンパク質相互作用部位の同定に成功すると共に、プロトンの透過と共役した構造変化をモニターする実験系の構築を示唆する成果も得られており、「SecDFによる膜透過昂進の分子メカニズムの解明」に向けては着実に進展していると考えている。加えて、実績概要で述べたように、他の膜タンパク質を用いた解析においても本研究手法の有効性が示せた事から、今後の更なる発展が期待できる。
上記課題に対しては、これまで使用していたベンゾイル基を持つ光反応性のアミノ酸アナログpBPAの代わりに、アジドを持つpAzPAを用いた実験系を用いて解析を進める。実験の手法は基本的に同じであり、amber suppression用のplasmidを交換するだけで良いので、速やかな進展が期待される。pAzPAを用いた光架橋実験は当研究室で既に行われており遂行に問題はないと考えられる。既に作製済みのSecDF(amber)変異体をそのまま転用できるため、迅速な遂行が期待できる。SecDFによる膜透過促進機構の解析については、本年の研究により明らかとなった基質結合クレバスの機能解析に焦点を当てて研究を進める。具体的には、クレバス内部のアミノ酸残基を対象にした徹底的な変異解析を進めると共に、機能発現に必須なアミノ残基の変異と掛け合わせた解析を進める事で、架橋形成の機能的重要性を検討する。早期の論文作製を目指して系統的な仕事を進める。高度好熱菌SecDFの立体構造上は離れているものの、架橋が形成されるアミノ酸残基部位を見出しており、この部位での架橋形成におけるイオノフォアの影響を調べる事により、SecDFのプロトン流入と共役した構造変化の実態を明らかにして行きたいと考えている。
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