| 研究領域 | 運動超分子マシナリーが織りなす調和と多様性 |
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| 研究課題/領域番号 |
24117006
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
中山 浩次 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (80150473)
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| 研究分担者 |
佐藤 啓子 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (70410579)
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| 研究期間 (年度) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| キーワード | 滑走運動 / 細菌 / 分泌機構 |
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| 研究実績の概要 |
バクテロイデーテス・フィラムの細菌は、海中・土壌・体内、様々な環境に広く分布している。これらの多くは、滑走運動と呼ばれる、表面上を動く能力がある。しかし、それは、べん毛、線毛など、他の細菌が持つ既知の運動様式とは根本的に異なる。この運動にはバクテロイデーテス・フィラムに特有の遺伝子群が関わっている。このことは、べん毛とType III 分泌装置のように、滑走運動とタンパク質分泌をつなぐような新しい装置がバクテロイデーテス細菌に存在することを示唆する。最速種である、Flavobacterium johnsoniae は、約2 um/sの速さでガラス表面上を動く。SprBは、700 kDaの巨大タンパク質で、そのアミノ酸配列や局在から、滑走時にはAdhesinとして機能すると考えられている。しかし、このビーズの動きが、SprBタンパク質の直接的な動きによるものかどうかは、わからない。そこで、我々は、この外膜タンパク質を、直接蛍光標識し、そのダイナミクスを詳しく調べた。運動時のSprBの挙動を直接可視化するために、SprBを抗体で標識した。化学固定した菌に対して、免疫蛍光法をおこなうと、SprBは、菌体表面に20-30個のシグナルとして検出できた。このシグナルが、膜上を動いているのか、確かめるために、化学固定せずに、免疫蛍光法をおこなった。ガラス上で運動をしている菌に対して、抗体を添加すると、濃度依存的に、ガラスへの結合能、運動能が、阻害された。つまり、SprBタンパク質は、滑走運動に直接関与する、外膜タンパク質であるといえる。抗体の濃度を100倍希釈して使用したとき、結合・運動能が約60%残っており、SprBの局在にも影響が見られなかった。このとき、興味深いことに、シグナルは膜に添って、菌体のまわりを左巻きラセン状に動きまわることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
付着因子SprBを蛍光抗体により標識することで菌を生きたままで滑走運動させ、SprBの動きを追うことができた。その結果、SprBが左巻きに菌体表面をラセン運動し、固体表面に付着すると菌が左回転で前進運動することがわかった点は計画以上の進展と思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画で注目しているSprBは，膜表面にある分子量700 kDaの巨大タンパク質であり，すでに，界面活性剤と，硫安分画を組み合わせることで，F. johnsoniae細胞から，粗精製画分を得ている。今後は，界面活性剤，ゲルろ過，イオン交換カラムの条件を検討することで，さらに精製度を上げ，最終的には，マシナリーを複合体として精製し，構成タンパク質も同定する。
この構成タンパク質の同定は単離したマシナリーの分子形状に関する情報を得ることにつながる．高速AFMでは，単離したマシナリーのナノレベルでの構造や物性を，リアルタイムで画像化できる。クライオ電子顕微鏡では，マシナリーやその周辺構造を様々な傾斜で撮影し，再構成することで，全体像を高解像度かつ3次元的に理解する．また，急速凍結フラクチャー電子顕微鏡では，滑走運動している細菌のガラス面を見ることができるので，機能中のマシナリーの構造多型をとらえることができる。これら一連の観察により，その分子形状だけでなく，機能を予測することも可能であと考えている．また，精製度が高いタンパク質は，結晶化，X線結晶構造解析により，原子レベルで構造を議論する。
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