計画研究
コフィリンはアクチンフィラメントと協同的に結合し、らせんピッチを短くすることが知られていた。そこでわれわれは、コフィリン結合に伴うアクチンフィラメントのらせんピッチの変化を高速AFMによりライブ観察した。その結果、コフィリン結合によるらせんピッチの短縮はコフィリンが結合している領域に留まらず、隣接するP端側のbare zoneへ一方向的に伝播することが判明した。コフィリンクラスターの伸長も、P端方向へ一方向的であった。この結果は、アクチン結合タンパク質の結合によるアクチンフィラメントの構造変化を初めてライブ観察した成果であり、さらにそうした構造変化は協同的で、一方向的に伝播しうることを示し、アクチンフィラメントの協同的構造変化が長距離にわたってアクチン結合タンパク質の結合を制御し、新規の信号伝達系となる可能性を示唆した。またわれわれは、ミオシンモータードメインもアクチンフィラメントと協同的に結合することを示してきたが、蛍光顕微鏡により、コフィリンとミオシンモータードメインが相互排他的にアクチンフィラメントと協同的に結合することを実証した。相互排他的な協同的結合を定量的および経時的に解析するため、アクチンフィラメントのガラス基板等への固定化方法を検討し、コフィリン、ミオシンモータードメインの協同的結合を損なわない固定化条件を確立した。さらに、種々のアクチン結合タンパク質のアクチン結合ドメイン(ABD)をGFPと融合して発現し、細胞前部や後部に局在するものを見出した。ABDはアクチン結合活性をもった小さなタンパク質ドメインなので、ABDと細胞内の特定のアクチンフィラメントの結合は、アクチンフィラメントの構造の差異を認識している可能性が高く、詳細なin vitro観察を進める予定である。この目的のため、多色同時観察が可能なTIRF顕微鏡を構築した。
2: おおむね順調に進展している
GFP-ABDの細胞内局在観察、およびABD―アクチン融合タンパク質を活用したABDとアクチンフィラメントの結合の全反射顕微鏡解析は、想定外の障害（たとえばHisタグが細胞内局在に影響することなど）の解決などに手間取り、当初予定より進捗がやや遅れている。一方、高速AFMによるコフィリン結合によるアクチンフィラメントの協同的構造変化の直接観察からは、アクチンフィラメントの一方向的な協同的構造変化が検出され、この点では当初想定を超えた成果が得られている。以上を総合し、全体としておおむね順調に進捗していると判断した。
GFP-ABDの細胞内局在観察、およびABD―アクチン融合タンパク質を活用したABDとアクチンフィラメントの結合の全反射顕微鏡解析については、準備が進んでいるので、このままの方向で推進する。コフィリン結合によるアクチンフィラメントの一方向的な協同的構造変化については、細部を詰め、ランクの高いジャーナルでの論文発表を目指す。また、ミオシン結合によるアクチンフィラメントの協同的構造変化については、コフィリン結合により誘起される構造変化よりは検出が困難であると予想されるので、いくつかの異なる検出方法を試みる予定である。
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