計画研究
植物の成長は遺伝的プログラムと外部環境により制御されている。転写因子複合体は内外の様々な刺激に応じて構成要素や修飾状態をダイナミックに変動させながら、遺伝子発現のパターンを決定する。本研究では光などの外部情報とジベレリン（GA）などの内部情報が、いかにして転写複合体の再構成・修飾により遺伝子発現を制御するのかを解明する。GAと環境刺激の信号伝達のクロストークの分子的実体を、転写因子複合体の再構成・修飾と捉え、転写サイクルにおける複合体の機能と動態の解析を目的とする。GA信号伝達の負の制御因子として同定されたDELLAは、複数の信号伝達経路のノードである。DELLAの生化学的な機能は不明であった。我々はDELLAが転写因子RSGのコアクティベーターとして機能することを明らかにし、さらにDELLAの結合因子として新たに転写因子GAF1を同定した。GAF1やAtRSGの標的遺伝子を解析するためにChIP-seqを計画している。ChIP-seqを行うためには転写複合体の精製が重要である。そこでGFP、FLAG、Strep-tagなどのタグが付加されたAtRSG, GAF1, DELLAを発現する形質転換体を作製した。形質転換体を用いて転写複合体の精製の条件検討を行ったところStrep-tagを用いた複合体の精製が特に有効であることが示された。分子遺伝学的解析からSPYはGA信号伝達の抑制因子であり、DELLAの機能を促進することが示唆されていた。SPYはGlcNAc化酵素であると予想されたが、その証明は無く標的タンパク質も不明であった。我々はSPYがGAF1複合体に含まれることを見出した。本年度はSPYによるGlcNAc修飾のin vitroアッセイ系を確立するために、大腸菌でSPYの発現・精製を試みたが、速やかに分解され精製は困難であることが示された。
2: おおむね順調に進展している
植物体からの転写複合体の精製には、Strep-tagが有効であることが見出されたので、ほぼ順調に進展したと考える。またRSGをリン酸し14-3-3との結合を促進するNtCDPK1は基質であるRSGだけでなく14-3-3とも直接結合することが示された。この結果はNtCDPK1がRSGキナーゼ以外の機能をもっていることを示唆しており興味深い。一方で、大腸菌内で発現させたSPYは急速に分解されるため組み換えタンパク質を精製することが困難であることが示された。全体としての達成度はほぼ順調と考えられる。
今年度の解析から形質転換植物を用いた場合、転写複合体の精製にはタグとしてはStrep-tagが有効であることが示された。今後はStrep-tagを付加したGAF1やAtRSGなどを植物体または培養細胞で発現させ転写複合体を単離・精製する。環境刺激により標的遺伝子がゲノムレベルでどのように変化するか次世代シークエンサーを用いたChIP-seqにより調べる。今年度の解析から大腸菌内で発現させたSPYは急速に分解されるため組み換えタンパク質を精製することが困難であることが示された。そこで今後は効率の高いin vitro翻訳系を用いてSPYを発現させ、SPYによるGlcNAc修飾活性の検出をめざす。RSGをリン酸化しRSGと14-3-3との結合を促進するキナーゼNtCDPK1はCa2+により活性化されると自己リン酸化される。さらにNtCDPK1はRSGと結合するだけでなく14-3-3とも結合することが示された。今後はNtCDPK1の自己リン酸化部位を決定し、非リン酸化変異型NtCDPK1を作製して、NtCDPK1の自己リン酸化の生理的意義を調べる。NtCDPK1と14-3-3の結合の機能的意義を調べる
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Plant J.
巻: 74 ページ: 652-662
10.1111/tpj.12154
