静的・動的分子構造解析を基盤とした転写サイクル制御機構研究

2013 年度 実績報告書

• 研究領域: 高精細アプローチで迫る転写サイクル機構の統一的理解
• 研究課題/領域番号: 24118005
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 緒方 一博 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90260330)
• 研究期間 (年度): 2012-06-28 – 2017-03-31
• キーワード: 転写因子 / X線結晶構造解析 / エンハンソソーム / Runx1 / Ets1 / TCR / LEF1

研究概要

本研究では、分子構造レベルでエンハンソソーム形成機構を解析し、細胞シグナル依存的な転写制御機構の解析と基本原理の解明を目指し、分子動力学などの計算科学による解析（中村らとの共同研究）のほか、バイオインフォマティックスの手法を取り入れ（松本らとの共同研究）、多角的な研究を行っている。
1) TCRαエンハンサー上に形成されるエンハンソソームの形成機構の全容を分子構造レベルで解明することを目指し、TCRαエンハンサー上に形成される(Runx1)2-DNA複合体の高分解構造（分解能2.6 Å）を得た。これまでに解明した複合体構造と組み合わせ、LEF1-(Runx1-CBFβ)2-Ets1-DNA七者複合体のモデルを構築した。このモデルから、エンハンソソーム形成において、転写因子間のアロステリック制御やタンパク質間相互作用による制御など、異なる相互作用様式が協調活性に関わっていることが明らかになりつつある。
2) 表面プラズモン共鳴法を用いて、Ets1の天然変性領域のリン酸化がEts1自身のDNA結合に与える影響を速度論的に解析した。Ets1の分子構造に基づいたアミノ酸変異導入実験により、天然変性領域の疎水性アミノ酸、およびDNA結合ドメインの塩基性アミノ酸が、リン酸化によるEts1の活性制御に重要であることを明らかにした。
3) 上記2)に関連して、DNA非結合状態のリン酸化Ets1の分子構造をX線結晶解析によって明らかにしたが、リン酸化部位の電子密度は観測されなかった。これは、リン酸化された領域の構造が結晶中で揺らいでいるためと考えられたため、中村らと共同で、分子動力学計算による解析に着手した。
4) 転写因子および転写関連タンパク質のアミノ酸変異が遺伝性疾患を引き起こすメカニズムについて、分子構造面から解析した（松本らとの共同研究）。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

不確定性の高い実験ステップである結晶化実験が比較的スムーズに進行し、分子構造に基づく機能解析へと展開できている。(Runx1-CBFβ)2-Ets1-DNA高次複合体など、分解能向上が困難なものもあったが、複合体を分割して結晶化することで、高分解高次複合体のモデルを構築できつつあり、概ね順調といえる。

今後の研究の推進方策

TCRエンハンサー複合体の制御機構解析については、隣接してDNAに結合するRunx1間の協調性のメカニズムに焦点を当てて解析を行う。リン酸化シグナルによるEts1の機能制御機構については、リン酸化Ets1（DNA非結合状態）のX線構造中に、リン酸化された領域の電子密度が観察されなかったため、分子動力学計算によるシミュレーションとともに、X線小角散乱実験を試みる。また、TCRエンハンサーのように細胞の分化段階に応じて機能するエンハンサーの解析に加え、環境刺激に応じて機能するエンハンサーの制御機構についても、分子構造解析を開始する。具体的には、酸化シグナルに応答して働く転写因子Nrf2を中心として形成されるエンハンソソームについて、X線結晶構造解析を行う。

研究成果

• [雑誌論文] A hemizygous GYG2 mutation and Leigh syndrome: a possible link? (2014)
  • 著者名/発表者名: Imagawa E, Osaka H, Yamashita A, Shiina M, Takahashi E, Sugie H, Nakashima M, Tsurusaki Y, Saitsu H, Ogata K, Matsumoto N, Miyake N
  • 雑誌名: Hum Genet 巻: 133 ページ: 225-234
  • DOI: 10.1007/s00439-013-1372-6
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] De novo SOX11 mutations cause Coffin-Siris syndrome (2014)
  • 著者名/発表者名: Y Tsurusaki, H Ohashi, S Phadke, E Koshimizu, I Kou, M Shiina, T Suzuki, N Okamoto, S Imamura, M Yamashita, S Watanabe, K Yoshiura, H Kodera, S Miyatake, M Nakashima, H Saitsu, K Ogata, S Ikegawa, N Miyake, N Matsumoto
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] KDM6A point mutations cause Kabuki syndrome (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyake N, Mizuno S, Okamoto N, Ohashi H, Shiina M, Ogata K, Tsurusaki Y, Nakashima M, Saitsu H, Niikawa N, Matsumoto N
  • 雑誌名: Hum Mutat 巻: 34 ページ: 108-110
  • DOI: 10.1002/humu.22229
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mitochondrial complex III deficiency caused by a homozygous UQCRC2 mutation presenting with neonatal-onset recurrent metabolic decompensation (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyake N, Yano S, Sakai C, Hatakeyama H, Matsushima Y, Shiina M, Watanabe Y, Bartley J, Abdenur JE, Wang RY, Chang R, Tsurusaki Y, Doi H, Nakashima M, Saitsu H, Ogata K, Goto Y, Matsumoto N
  • 雑誌名: Hum Mutat 巻: 34 ページ: 446-452
  • DOI: 10.1002/humu.22257
  • 査読あり
• [雑誌論文] Exome sequencing identifies a novel INPPL1 mutation in opsismodysplasia (2013)
  • 著者名/発表者名: Iida A, Okamoto N, Miyake N, Nishimura G, Minami S, Sugimoto T, Nakashima M, Tsurusaki Y, Saitsu H, Shiina M, Ogata K, Watanabe S, Ohashi H, Matsumoto N, Ikegawa S
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 58 ページ: 391-394
  • DOI: 10.1038/jhg.2013.25
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of KLHL41 mutations implicates BTB-Kelch-mediated ubiquitination as an alternate pathway to myofibrillar disruption in nemaline myopathy (2013)
  • 著者名/発表者名: Gupta V, Shiina M, Ogata K, Matsumoto N, Beggs N et al.
  • 雑誌名: Am J Hum Gene 巻: 93 ページ: 1108-1117
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2013.10.020
  • 査読あり
• [雑誌論文] De Novo mutations in GNAO1, encoding a Gαo subunit of heterotrimeric G proteins, cause epileptic encephalopathy (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakamura K, Kodera H, Akita T, Shiina M, Kato M, Hoshino H, Terashima H, Osaka H, Nakamura S, Tohyama J, Kumada T, Furukawa T, Iwata S, Shiihara T, Kubota M, Miyatake S, Koshimizu E, Nishiyama K, Nakashima M, Tsurusaki Y, Miyake N, Hayasaka K, Ogata K, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H
  • 雑誌名: Am J Hum Genet 巻: 93 ページ: 496-505
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2013.07.014
  • 査読あり
• [学会発表] Allosteric Regulation of a Multiple Transcription Factor Assembly on an Enhancer DNA (2013)
  • 著者名/発表者名: Shiina M, Hamada K, Inoue-Bungo T, Shimamura M, Uchiyama A, Baba S, Ko Sato K, Yamamoto M, Ogata K
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] Mechanisms of DNA recognition by the Nrf2-containing transcription factor heterodimer (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki K, Shiina M, Hamada K, Bungo T, Baba S, Ohta T, Ogata K
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] The cooperative activity of Ets1 and Runx1 on various target gene enhancers and the effect of phosphorylation of Ets1 on the cooperation (2013)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama A, Shiina M, Hamada K, Bungo T, Shimamura M, Ogata K
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] Structural analyses for the effects of Ets1 phosphorylation on Ets1-containing TF-DNA assemblies (2013)
  • 著者名/発表者名: Shiina M, Hamada K, Inoue-Bungo T, Shimamura M, Uchiyama A, Baba S, Sato K, Yamamoto M, Tahirov TH, Ogata K
  • 学会等名: HUPO 2013（12th Human Proteome Organization Annual World Congress）
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 20130914-20130918
• [学会発表] Cooperative Formation of a Multiple Transcription Factor Assembly on an Enhancer DNA and Its Regulation by Phosphorylation of a Transcription Factor via a Cell Signaling (2013)
  • 著者名/発表者名: Shiina M, Hamada K, Inoue-Bungo T, Shimamura M, Uchiyama A, Baba S, Sato K, Ogata K
  • 学会等名: HUPO 2013（12th Human Proteome Organization Annual World Congress）
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 20130914-20130918
• [学会発表] Crystal structural analysis of drosophila nucleosome assembly protein (2013)
  • 著者名/発表者名: Hamada K, Shiina M, Nakashima R, Saito M, Ito T, Ogata K
  • 学会等名: 4th International Symposium on Diffraction Structural Biology
  • 発表場所: 名古屋市中小企業振興会館（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 20130526-20130529
• [学会発表] DNA-mediated allosteric regulation in a complex of multiple transcription factors with DNA (2013)
  • 著者名/発表者名: Shiina M, Hamada K, Inoue-Bungo T, Shimamura M, Uchiyama A, Baba S, Sato K, Ogata K
  • 学会等名: 4th International Symposium on Diffraction Structural Biology
  • 発表場所: 名古屋市中小企業振興会館（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 20130526-20130529
• [図書] 見てわかる構造生命科学;生命科学研究へのタンパク質構造の利用 中村春木編 (2014)
  • 著者名/発表者名: 椎名政昭、緒方一博
  • 総ページ数: 320
  • 出版者: 化学同人