静的・動的分子構造解析を基盤とした転写サイクル制御機構研究

2014 年度 実績報告書

• 研究領域: 高精細アプローチで迫る転写サイクル機構の統一的理解
• 研究課題/領域番号: 24118005
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 緒方 一博 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90260330)
• 研究期間 (年度): 2012-06-28 – 2017-03-31
• キーワード: 転写因子 / X線結晶構造解析 / エンハンソソーム / Runx1 / Ets1 / Nrf2 / リン酸化

研究実績の概要

本研究では、分子構造レベルでエンハンソソーム形成機構を解析し、細胞シグナル依存的な転写制御機構の解析と基本原理の解明を目指し、分子動力学等の計算科学による解析（中村らとの共同研究）のほか、バイオインフォマティックスの手法を取り入れ（松本らとの共同研究）、多角的に研究を行っている。
1)TCRαエンハンサー上に形成されるエンハンソソーム中には、二分子のRunx1がDNAに隣接して協調的に結合し、エンハンソソームのコアを形成している。この二分子のRunx1間の協調的DNA結合活性は、Runx1のDNA結合ドメイン (Runtドメイン)のN末端側の天然変性領域を介して発揮されることを我々は明らかにした。このRuntドメインのN末端の天然変性領域を含めてRunx1-Runx1-DNA三者複合体の結晶化を行い、予備的な回折実験を完了した。
2)Ets1の天然変性領域のリン酸化がEts1自身のDNA結合活性を抑制する機構を調べるため、中村らと共同で、計算による分子シミュレーションを行った。その結果、リン酸化を受けた天然変性領域が、Ets1のDNA結合面と相互作用することでDNAと競合し、DNA結合を抑制していることが示唆された。
3)酸化ストレス応答遺伝子群の発現を制御する転写因子Nrf2は、小Mafタンパク質群をはじめとしたbZIP型転写因子とヘテロ２量体を形成して抗酸化剤応答領域（ARE）に結合して転写を活性化する。H26年度は、天然型のARE配列に形成されるNrf2-MafG-DNA複合体の高分解Ｘ線結晶構造を決定した（投稿準備中）。
4)転写因子および転写関連タンパク質のアミノ酸変異が遺伝性疾患を引き起こすメカニズムについて、分子構造面から解析した（松本らとの共同研究）。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

タンパク質-DNA複合体の結晶化実験が比較的順調に進行し、十分な分子構造情報が得られてきている。特に、Nrf2-MafG-DNA複合体の構造解析が順調に進んだ点が研究の進展に繋がった。Nrf2-MafG-DNA複合体の結晶化実験では、Nrf2, MafGおよびDNAを混合して複合体を調製するが、MafGはホモ２量体としてDNAと相互作用することが可能なため、この溶液中でMafGホモ２量体とDNAとの複合体、およびNrf2-MafGヘテロ２量体とDNAとの複合体が混在してしまう。そのため、後者の複合体のみを結晶化するのは困難であったが、DNA配列やタンパク質比の最適化によって最適な結晶化条件を見出すことができた。Ets1の天然変性領域についての分子シミュレーションは、これまでに例のない大規模な計算となったが、H26年度内に完了することができた。シミュレーションによって、天然変性領域の振る舞いが、化学修飾を受けることによってどのように変化するのかを理解する上で大変有用な情報が得られている。

今後の研究の推進方策

TCRαエンハンソソームの形成制御機構の解析については、分子構造面からの解析は順調に進んできている。機能解析も進行中であるが、解析対象のエンハンソソームは構成分子が多く、レポータープラスミドと多種類の転写因子を強制発現させるという、従来の人工的な転写活性化実験による解析が限界に来ている。すなわち、従来法では、TCRの発現に必須であることが個体レベルで証明されているLEF1等の転写因子による転写活性化への寄与が、はっきりと観察されないのである。これは、レポーター遺伝子がプラスミドに挿入されているため、ヌクレオソーム形成やヒストン修飾等の点で天然のエンハンサー領域が再現されていない等の理由が考えられる。そこで、今後はゲノムにレポーター遺伝子を組み込む等、より生理的な条件下で解析できる細胞実験系を立ち上げる予定である。この他にも、領域内の共同研究として、個別のエンハンサー領域に形成されるタンパク質-核酸複合体をまるごと単離可能な技術であるenChIP実験等、より天然に近い状態での転写制御機構の解析を可能とする実験を立ち上げる計画である。
Nrf2については、酸化ストレスの制御因子として注目が高まっており、研究競争も激しくなってきている。そこで、まずはNrf2-MafG-DNA複合体の結晶構造の論文発表へ向けて準備していきたい。

研究成果

• [雑誌論文] GRIN1 mutations cause encephalopathy with infantile-onset epilepsy, and hyperkinetic and stereotyped movement disorders (2015)
  • 著者名/発表者名: Ohba C, Shiina M, Tohyama J, Haginoya K, Lerman-Sagie T, Okamoto N, Blumkin L, Lev D, Mukaida S, Nozaki F, Uematsu M, Onuma A, Kodera H, Nakashima M, Tsurusaki Y, Miyake N, Tanaka F, Kato M, Ogata K, Saitsu H, Matsumoto N
  • 雑誌名: Epilepsia 巻: 56(6) ページ: 841-848
  • DOI: 10.1111/epi.12987
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel allosteric mechanism on protein-DNA interactions underlying the phosphorylation-dependent regulation of Ets1 target gene expressions (2015)
  • 著者名/発表者名: Shiina M, Hamada K, Inoue-Bungo T, Shimamura M, Uchiyama A, Baba S, Sato K, Yamamoto M, Ogata K
  • 雑誌名: J Mol Biol 巻: 427(8) ページ: 1655-1669
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2014.07.020
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Crystallization of the Ets1-Runx1-CBFβ-DNA complex formed on the TCRα gene enhancer (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiina M, Hamada K, Inoue-Bungo T, Shimamura M, Baba S, Sato K, Ogata K
  • 雑誌名: Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 巻: 70 ページ: 1380-1384
  • DOI: 10.1107/S2053230X14018470
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] De novo SOX11 mutations cause Coffin-Siris syndrome (2014)
  • 著者名/発表者名: Tsurusaki Y, Koshimizu E, Ohashi H, Phadke S, Kou I, Shiina M, Suzuki T, Okamoto N, Imamura S, Yamashita M, Watanabe S, Yoshiura K, Kodera H, Miyatake S, Nakashima M, Saitsu H, Ogata K, Ikegawa S, Miyake N, Matsumoto N
  • 雑誌名: Nature Commun 巻: 5 ページ: -
  • DOI: 10.1038/ncomms5011
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Deep sequencing detects very-low-grade somatic mosaicism in the unaffected mother of siblings with nemaline myopathy. (2014)
  • 著者名/発表者名: Miyatake S, Koshimizu E, Hayashi YK, Miya K, Shiina M, Nakashima M, Tsurusaki Y, Miyake N, Saitsu H, Ogata K, Nishino I, Matsumoto N
  • 雑誌名: Neuromuscul Disord 巻: 24 ページ: 642-647
  • DOI: 10.1016/j.nmd.2014.04.002
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Expanding the phenotypic spectrum of TUBB4A-associated hypomyelinating leukoencephlopathies (2014)
  • 著者名/発表者名: Miyatake S, Osaka H, Shiina M, Sasaki M, Takanashi J, Haginoya K, Wada T, Morimoto M, Ando N, Ikuta Y, Nakashima M, Tsurusaki Y, Miyake N, Ogata K, Matsumoto N, Saitsu H
  • 雑誌名: Neurology 巻: 82 ページ: 2230-2237
  • DOI: 10.1212/WNL.0000000000000535
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A hemizygous GYG2 mutation and Leigh syndrome: a possible link? (2014)
  • 著者名/発表者名: Imagawa E, Osaka H, Yamashita A, Shiina M, Takahashi E, Sugie H, Nakashima M, Tsurusaki Y, Saitsu H, Ogata K, Matsumoto N, Miyake N
  • 雑誌名: Hum Genet 巻: 133 ページ: 225-234
  • DOI: 10.1007/s00439-013-1372-6
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Late-onset spastic ataxia phenotype in a patient with a homozygous DDHD2 mutation (2014)
  • 著者名/発表者名: Doi H, Ushiyama M, Baba T, Tani K, Shiina M, Ogata K, Miyatake S, Fukuda-Yuzawa Y, Tsuji S, Nakashima M, Tsurusaki Y, Miyake N, Saitsu H, Ikeda S, Tanaka F, Matsumoto N, Yoshida K
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1038/srep07132
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Kinetic characterization of a DNA binding activity of the transcription factor Ets1 and its regulation by phosphorylation at an intrinsically disordered region (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiina M, Hamada K, Bungo-Inoue T, Shimamura M, Uchiyama A, Baba S, Sato K, Suzuki K, Yamamoto M, Ogata K
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] Orientation of Ets1 and Runx1 binding sites on enhancers and their cooperative regulation (2014)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama A, Shiina M, Hamada K, Bungo T, Shimamura M, Ogata K
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] Structure-based analysis for DNA recognition mechanism of the Nrf2-containing transcription factor heterodimer (2014)
  • 著者名/発表者名: Suzuki K, Shiina M, Hamada K, Bungo T, Okada C, Baba S, Ohta T, Ogata K
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] ヒストンシャペロンNap1の構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 浜田恵輔，椎名政昭，中島理沙，斎藤 誠，伊藤 敬，緒方一博
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府・京都市）
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] Regulation of DNA binding of Ets1 by phosphorylation in an intrinsic disordered region (2014)
  • 著者名/発表者名: 椎名政昭，浜田恵輔，井上－豊後泰子，嶋村麻利子，馬場しほ，内山晃子，鈴木香絵，タヒロフ タヒール，緒方一博
  • 学会等名: 第14回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: ワークピア横浜（神奈川県・横浜市）
  • 年月日: 2014-06-25 – 2014-06-27
  • 招待講演
• [図書] 見てわかる構造生命科学 生命科学研究へのタンパク質構造の利用 中村春木編 (2014)
  • 著者名/発表者名: 椎名政昭，緒方一博
  • 総ページ数: 28
  • 出版者: 化学同人
• [備考] 横浜市立大学大学院医学研究科生化学ホームページ
  • URL: http://www-user.yokohama-cu.ac.jp/~seika/index.html
• [備考] 転写サイクルホームページ
  • URL: http://transcriptioncycle.org