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2013 年度 実績報告書

高度化した一分子蛍光計測によるタンパク質の構造形成運動の解明

計画研究

研究領域理論と実験の協奏による柔らかな分子系の機能の科学
研究課題/領域番号 25104007
研究種目

新学術領域研究(研究領域提案型)

研究機関東北大学

研究代表者

高橋 聡  東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30283641)

研究期間 (年度) 2013-06-28 – 2018-03-31
キーワード一分子蛍光観察 / ファージ・ディスプレイ法 / タンパク質フォールディング / 一分子選別装置
研究概要

1)タンパク質のフォールディング過程の解明:数十マイクロ秒の時間分解能で、一分子の蛍光強度変化を連続追跡する装置を開発し、タンパク質の高速度ダイナミクスを追跡する研究を展開した。プロテインAのBドメイン(BdpA)を取り上げ、Alexa488と633にてラベルしたBdpAについて平衡変性過程を一分子観察し、得られた結果からタンパク質の運動性に関する解析を行った。変性したBdpAがサブミリ秒の時間領域で揺らぎ運動を行うことを見いだした。
次に、ユビキチンを取り上げた。ユビキチンの2番目と65番目の残基にシステインを導入しAtto532とAlexa647にてラベル化した。高速一分子蛍光計測を行ったところ、複数の中間状態が存在し、変性剤濃度により敏感に分布を変化させることが示唆された。また、溶液混合セルを用いて天然状態にあるユビキチンを高濃度の変性剤と混合し、混合後の運動を一分子観察する実験を可能にした。
2)タンパク質デザインを目指した一分子ソーターの開発:ファージ・ディスプレイ法と蛍光観察装置を組み合わせることで、さまざまな配列を持つライブラリーから、目的の構造や特性を持つタンパク質を一分子レベルで選択を行う実験手法の確立を目指した。焦点深度を大きく設定した光学系を開発した。また、さや流セルを開発し、選別する試料が流路の中心部のみを流すことに成功した。また、ソレノイドバルブを用いることで、1秒間に数分子を選別することを可能にした。
M13ファージのg3pタンパク質表面に、緑色蛍光タンパク質(GFP)のC末端断片を発現させた。このファージに別に精製したGFPのN末側断片を混ぜるとGFPが再構成され、GFP蛍光が観察されることを確認した。さらに、GFPを再構成したファージを一個体ごとに観察できることを確認した。このファージを用いた選別実験を行う予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度の計画として,以下の三つの項目を提出した。第一は、タンパク質のフォールディング運動を、マイクロ秒から数十秒の時間スケールにおける「一分子動画」の観察技術を用いて解明する。観察対象として、プロテインAのBドメイン、ユビキチンを試料とした高速フォールディング運動と、マルトース結合タンパク質が分子シャペロンであるGroELと相互作用しながらフォールディングする運動を取り上げる。第二は、STMとラマン散乱法を組み合わせた探針増強ラマン分光法を用いて、生体膜表面においてタンパク質が線維状に凝集する過程を観察する。リゾチームが凝集した線維の形態をSTMにより観察し、線維の中における分子構造をラマン散乱により推定し両者の相関を見いだす。第三は、一分子ソーターとファージディスプレイ法を組み合わせ、タンパク質に他の分子を結合させる機能を付与する手法の開発を試みる。この手法の現実性を示すことを目標とする。
以上の計画のなかで、第一の項目であるプロテインAのBドメイン、および、ユビキチンを用いた観測は順調に進み、数ヶ月以内の論文化を目指している。また、GroELとの相互作用を調べる研究では、基質タンパク質をマルトース結合タンパク質から青色発光タンパク質に変更し、実験系の構築に努力を続けている。また、第三の項目についても、一分子選別装置の高感度化と高速度化に成功し、さらに、緑色蛍光タンパク質をファージ表面に発現することに成功した。以上の項目については、計画時に期待した以上の成果が得られている。
一方で、STMとラマン散乱法を組み合わせた先端増強ラマン法については、十分な進展を得られなかった。以上を勘案し、概ね順調に進展していると自己評価する。

今後の研究の推進方策

H26年度は、H25年度に大きな進展が見られた高速一分子蛍光測定と一分子選択実験に集中する予定である。特に、1)タンパク質の非平衡運動を観察するための溶液混合装置と2)新規高感度光検出器HPDを使った高速一分子蛍光観察装置の性能の向上などの装置開発を行う。1)は、二つの溶液を100マイクロ秒以内に混合し、混合後の分子運動を一分子観察するための装置であり、H25年度に予備的な装置開発を開始したものである。すでに、ユビキチンを用いた運動観察に装置を応用したデータを得ている。2)は、高速一分子蛍光測定の検出器に、これまでのEM-CCDではなく、単一光子の到達時間を計測できるHPDを用いるものである。これについても、予備実験を開始しており、20マイクロ秒の時間分解能で5ミリ秒以上の長時間にわたって、単一分子の蛍光時系列データを得られることを示している。以上の装置開発により、一分子蛍光観察の可能性を大きく広げることを目標とする。
以上の装置開発とあわせて、一分子選別装置を用いたタンパク質デザインについて、研究努力を集中する。H26年度は、選別したファージの回収を確認し、複数のファージを選別回収することが可能であることを示すことで、論文としてまとめる予定である。その上で、実際にライブラリーを構築し、選別する実験を実施する予定である。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2013

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (10件) (うち招待講演 2件) 図書 (1件)

  • [雑誌論文] Tip-enhanced Raman spectroscopy of 4,4′-bipyridine and 4,4′-bipyridine N,N'-dioxide adsorbed on gold thin films2013

    • 著者名/発表者名
      I.I. Rzeznicka, H.Horino, N. Kikkawa, S. Sakaguchi, A.Morita, S. Takahashi, T. Komeda, H. Fukumura, T. Yamada, M. Kawai
    • 雑誌名

      Surface Science

      巻: 617 ページ: 1-9

    • DOI

      10.1016/j.susc.2013.08.010

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Serum Amyloid A3 Binds MD-2 To Activate p38 and NF-kB Pathways in a MyD88-Dependent Manner2013

    • 著者名/発表者名
      Atsuko Deguchi, Takeshi Tomita,Tsutomu Omori, Akiko Komatsu, Umeharu Ohto, Satoshi Takahashi, Natsuko Tanimura, Sachiko Akashi-Takamura, Kensuke Miyake and Yoshiro Maru
    • 雑誌名

      he Journal of Immunology

      巻: 15 ページ: 1856-1854

    • DOI

      10.4049/jimmunol.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Microsecond dynamics of an unfolded protein by a line confocal tracking of single molecule fluorescence2013

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa, Yuta Suzuki, Masataka Saito, Kiyoto Kamagata, Munehito Arai, Satoshi Takahashi
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 3 ページ: 2151

    • DOI

      10.1038/srep02151.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] A New Way to Degrade Heme -THE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ENZYME MhuD CATALYZES HEME DEGRADATION WITHOUT GENERATING CO*-2013

    • 著者名/発表者名
      Shusuke Nambu, Toshitaka Matsui, Celia W. Goulding, Satoshi Takahashi, Masao Ikeda-Saito
    • 雑誌名

      The Journal of Biological Chemistry

      巻: 288 ページ: 10101-10109

    • DOI

      10.1074/jbc.

    • 査読あり
  • [学会発表] 単分子蛍光観察によるがん抑制因子p53の物理学2013

    • 著者名/発表者名
      鎌形清人
    • 学会等名
      第9回先端レーザー分光の若手シンポジウム  Frontiers of Advanced Laser Spectroscopy レーザー分光による分子科学の新しい展開(,和光市,(2013.12.3)
    • 発表場所
      埼玉県和光市
    • 年月日
      20131203-20131203
    • 招待講演
  • [学会発表] がん抑制因子p53の物理学2013

    • 著者名/発表者名
      鎌形清人
    • 学会等名
      第2回生命科学若手交流研究会
    • 発表場所
      宮城県仙台市
    • 年月日
      20131128-20131130
    • 招待講演
  • [学会発表] Direct observation of the multiple sliding modes of a tumor suppressor p532013

    • 著者名/発表者名
      Agato Murata, Risa Kashima, Yuji Itoh, Takashi Tokino, Satoshi Takahashi, Kiyoto Kamagata
    • 学会等名
      The 51th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
    • 発表場所
      京都府京都市
    • 年月日
      20131028-20131030
  • [学会発表] Dynamics of ubiquitin folding detected by single molecule fluorescence spectroscopy2013

    • 著者名/発表者名
      Masataka Saito, Chen Hsin-Liang, Chen Rita, Kiyoto Kamagata, Hiroyuki Oikawa, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      The 51th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
    • 発表場所
      京都府京都市
    • 年月日
      20131028-20131030
  • [学会発表] Improvements of the line confocal system for the single molecule tracking of fast folding dynamics of the B domain of protein A2013

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa, Kiyoto Kamagata, Munehito Arai, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      The 51th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
    • 発表場所
      京都府京都市
    • 年月日
      20131028-20131030
  • [学会発表] Investigation of p53’s Linker Region Role Using Single Molecule Fluorescence Microscopy2013

    • 著者名/発表者名
      Toshihiko Kubota, Hiroyuki Oikawa, Kiyoto Kamagata, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      The 51th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
    • 発表場所
      京都府京都市
    • 年月日
      20131028-20131030
  • [学会発表] Microsecond-resolved Tracking of the Unfolded State of BdpA by a Line Confocal Detection of Single Molecule Fluorescence2013

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa, Yuta Suzuki, Masataka Saito, Kiyoto Kamagata, Munehito Arai, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      Technologies for Medical Diagnosis and Therapy Symposium
    • 発表場所
      China, Taipei
    • 年月日
      20131021-20131022
  • [学会発表] Direct observation of the multiple sliding modes of a tumor suppressor p532013

    • 著者名/発表者名
      Agato Murata, Risa Kashima, Yuji Itoh, Takashi Tokino, Satoshi Takahashi, Kiyoto Kamagata
    • 学会等名
      International Symposium for the 70th Anniversary of the Tohoku Branch of the Chemical Society of Japan
    • 発表場所
      宮城県仙台市
    • 年月日
      20130928-20130930
  • [学会発表] Microsecond dynamics of Ubiquitin folding detected by single molecule fluorescence spectroscopy2013

    • 著者名/発表者名
      Masataka Saito, Hsin-Liang Chen, Rita P.-Y. Chen, Kiyoto Kamagata, Hiroyuki Oikawa, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      International Symposium for the 70th Anniversary of the Tohoku Branch of the Chemical Society of Japan
    • 発表場所
      宮城県仙台市
    • 年月日
      20130928-20130930
  • [学会発表] 一分子蛍光計測によるがん抑制因子p53のDNA探索機構の解明2013

    • 著者名/発表者名
      村田崇人, 高橋聡, 鎌形清人
    • 学会等名
      第86回日本生化学会大会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市
    • 年月日
      20130911-20130913
  • [図書] 「揺らぎ・ダイナミクスと生体機能~物理化学的視点から見た生体分子~」2013

    • 著者名/発表者名
      小井川浩之・鎌形清人・高橋聡
    • 総ページ数
      14
    • 出版者
      化学同人

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公開日: 2015-05-28  

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