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2014 年度 実績報告書

高度化した一分子蛍光計測によるタンパク質の構造形成運動の解明

計画研究

研究領域理論と実験の協奏による柔らかな分子系の機能の科学
研究課題/領域番号 25104007
研究機関東北大学

研究代表者

高橋 聡  東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30283641)

研究期間 (年度) 2013-06-28 – 2018-03-31
キーワード一分子蛍光観察 / タンパク質のフォールディング
研究実績の概要

本研究は、新しい一分子分光計測法と関連技術を開発し、タンパク質のフォールディング過程や機能発現過程に応用すること、さらに新規タンパク質をデザインすることを目標として計画した。本年度は、以下の進展が見られた。
1.ラインフォーカス型一分子の蛍光観察装置を用いて、タンパク質のフォールディング運動を観察し、データの解析方法を深化させた。プロテインAのBドメインについて、二つのラベル化試料を一分子観察し、サブミリ秒の時間領域で揺らぎ運動を行うことを見いだした。ユビキチンの2番目と65番目の残基にAtto532とAlexa647をラベルした。得られた試料を用いて、再現性よく一分子蛍光データを得るための測定条件を確立した。
2.ハイブリッド型フォトダイオードとラインフォーカス型共焦点顕微鏡を組み合わせた高時間分解能一分子観測装置を開発した。本装置を用いることで10マイクロ秒の時間分解能で10ミリ秒程度の観測時間一分子蛍光観察を可能にした。装置を用いてプロテインAのBドメインの計測を行った。
3.発癌制御因子であるp53がDNA上を滑り運動し、標的配列を探索する過程を一分子観察法で追跡した。フローセルの内面にλDNAを伸長した状態で固定し、蛍光色素をラベルしたp53を導入した。このセルを自作の全反射蛍光顕微鏡に設置し、p53がDNA上を滑り運動をする様子を観察した。その結果、p53が幾つかの拡散定数を示すことを見いだした。
4.ファージ・ディスプレイ法と一分子蛍光観察装置を組み合わせ、目的のタンパク質を提示したファージを選択する手法の確立を目指した。GFPのC末端断片を提示したファージにGFPのN末側断片を混ぜ、ファージ表面にGFPを再構成させた。このファージを一分子選別装置により観察・選別し、さらに、回収を可能にした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

上述したように、本研究により4つの研究課題において大きな進展が見られた。これらの成果は、当初の想定を大きく越えるものである。

今後の研究の推進方策

次年度はハイブリッド型光検出器を用いた一分子蛍光観察実験を完成させると共に、溶液混合装置と一分子観察を組み合わせた非定常状態における一分子観察を成功させる。また、ファージを選別させる実験も成功させる。これらの研究を行うためのスタッフ、学生等も充実しており、十分な進展が期待できる。

  • 研究成果

    (19件)

すべて 2015 2014

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (18件) (うち招待講演 4件)

  • [雑誌論文] マイクロ秒分解一分子蛍光測定で観るタンパク質の構造変化2014

    • 著者名/発表者名
      小井川浩之、齊藤雅嵩、高橋聡
    • 雑誌名

      生物物理

      巻: 54 ページ: 276-279

    • DOI

      10.2142/biophys.54.276

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Development of The Line Confocal System for The Single Molecule Tracking of Folding Dynamics of Proteins2015

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa , Kiyoto Kamagata, Munehito Arai, Atuhito Fukasawa, Hiroaki Yokota, Toru Ide, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      Biophysical Society 59th Annual Meeting
    • 発表場所
      Baltimore, USA
    • 年月日
      2015-02-07 – 2015-02-11
  • [学会発表] Dynamics of Protein Folding Studied by Single Molecule Fluorescence Time Series Measurements at Microsecond Resolution2014

    • 著者名/発表者名
      Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      Indo-Jpanan Joint Workshop on "Frontiers in Molecular Spectroscopy : Fundamentals and Applications to Material and Biology"
    • 発表場所
      Nara, Japan
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-28
    • 招待講演
  • [学会発表] Folding dynamics of ubiquitin after rapid mixing detected by single molecule fluorescence spectroscopy2014

    • 著者名/発表者名
      Masataka Saito, Chen Erick, Chen Po-Ting, Chen Rita P.-Y., Kiyoto Kamagata, Hiroyuki Oikawa, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      第52回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      北海道札幌市
    • 年月日
      2014-09-25 – 2014-09-27
  • [学会発表] Development of the line confocal system for the single molecule tracking of fast folding dynamics of proteins2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa Kiyoto Kamagata, Munehito Arai, Atsuhito Fukasawa, Hiroaki Yokota, Toru Ide, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      第52回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      北海道札幌市
    • 年月日
      2014-09-25 – 2014-09-27
  • [学会発表] Conformation of the denatured BFP bound to GroEL by single molecule FRET measurements2014

    • 著者名/発表者名
      Aya Yoshida, Fumihiro Motojima, Hiroyuki OIkawa, Kiyoto Kamagata, Masasuke Yoshida and Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      第52回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      北海道札幌市
    • 年月日
      2014-09-25 – 2014-09-27
  • [学会発表] Observation of the Search Dynamics of p53 for the Targent DNA Sequence by Single-molecule Fluorescence Microscopy2014

    • 著者名/発表者名
      Yuji Itoh、Agato Murata, Seiji Sakamoto, Takehiko Wada, Satoshi Takahasi, and Kiyoto Kamagata
    • 学会等名
      第52回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      北海道札幌市
    • 年月日
      2014-09-25 – 2014-09-27
  • [学会発表] Development of a new strategy of protein design: the single phage sorting based on fluorescence intensity2014

    • 著者名/発表者名
      Rie Kiriguchi, Toshihiko Kubota, Norihisa Takahashi, Seiji Sakamoto, Hiroyuki Oikawa, Kiyoto Kamagata , Takehiko Wada, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      第52回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      北海道札幌市
    • 年月日
      2014-09-25 – 2014-09-27
  • [学会発表] Investigation of DNA search mechanism of tumor suppressor p532014

    • 著者名/発表者名
      Agato Murata, Yuji Itoh, Dwiky Subekti Rendra Graha, Chihiro Igarashi, Satoshi Takahashi and Kiyoto Kamagata
    • 学会等名
      第52回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      北海道札幌市
    • 年月日
      2014-09-25 – 2014-09-27
  • [学会発表] タンパク質フォールディングの分子科学2014

    • 著者名/発表者名
      高橋聡
    • 学会等名
      第1回森野ディスカッション いつもそこには分子がある
    • 発表場所
      東京大学・小柴ホール
    • 年月日
      2014-08-29 – 2014-08-29
    • 招待講演
  • [学会発表] Continuous tracking of protein folding at microsecond resolution by a line confocal detection of single molecule fluorescence2014

    • 著者名/発表者名
      Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      The 28th Annual Symposium of The Protein Society
    • 発表場所
      San Diego, USA
    • 年月日
      2014-07-27 – 2014-07-30
    • 招待講演
  • [学会発表] Development of the line confocal system for the single-molecule tracking of the protein folding transition2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa
    • 学会等名
      International Workshop "Over the Barriers of Transition Paths: Dynamical Processes in Proteins and Complex Molecular Systems"
    • 発表場所
      神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-06-28 – 2014-06-28
    • 招待講演
  • [学会発表] GroELに結合した基質BFPの一分子FRET計測による構造解析2014

    • 著者名/発表者名
      吉田文・元島史尋・田口英樹・小井川浩之・鎌形清人・吉田賢右・高橋聡
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-28
  • [学会発表] 癌抑制蛋白質p53のDNA探索機構の研究2014

    • 著者名/発表者名
      村田崇人・伊藤優志・Dwiky Subekti Rendra Graha・鹿島理沙・時野隆志・高橋聡・鎌形清人
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-28
  • [学会発表] 一分子蛍光分光法によるユビキチンの折り畳みダイナミクス2014

    • 著者名/発表者名
      齊藤雅嵩・Chen Hsin-Liang・Chen Po-Ting・Chen Rita P.-Y.・鎌形清人・小井川浩之・高橋聡
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-28
  • [学会発表] 改良したマイクロ秒分解一分子蛍光測定法による蛋白質の高速折り畳みダイナミクスの追跡2014

    • 著者名/発表者名
      小井川浩之・鎌形清人・ 新井宗仁・ 深澤宏仁・横田浩章・井出徹・高橋聡
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-28
  • [学会発表] タンパク質単分子の構造変化を計測する暗視野顕微鏡の開発2014

    • 著者名/発表者名
      鎌形清人・間野絵梨子・七谷圭・阿蘇裕樹・井上裕一・小井川浩之・高橋聡
    • 学会等名
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市
    • 年月日
      2014-06-25 – 2014-06-28
  • [学会発表] Microsecond-dynamics of the unfolded BdpA and ubiquitin by a line confocal detection of single molecule fluorescence2014

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Oikawa , Masataka Saito, Po-Ting Chen, Hsin-Liang Chen, Rita P.-Y. Chen, Munehito Arai, Kiyoto Kamagata, Satoshi Takahashi
    • 学会等名
      The 4th Asia Pacific Protein Association Conference
    • 発表場所
      Jeju, Korea
    • 年月日
      2014-06-17 – 2014-06-20
  • [学会発表] Target Search Process of A Tumor Suppressor p53 Revealed by Single-Molecule Fluorescence Microscopy2014

    • 著者名/発表者名
      Agato Murata, Yuji Ito, Risa Kashima, Takashi Tokino, Satoshi Takahashi and Kiyoto Kamagata
    • 学会等名
      The 16th International p53 workshop
    • 発表場所
      Stockholm, Sweden
    • 年月日
      2014-06-15 – 2014-06-19

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公開日: 2016-06-01  

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