計画研究
新学術領域研究(研究領域提案型)
生殖細胞では遺伝情報を体細胞よりも厳密に継承する分子機構が働くが、減数分裂期には逆にゲノムDNAを積極的に組換えると共にクロマチン動態の大規模な転換が起こる。生殖幹細胞から減数分裂期に起こるゲノム・エピゲノム制御の詳細な研究は進んでいない。研究代表者らはマウス生殖幹細胞株 (GS 細胞株) が体細胞型増殖から第１減数分裂前期に移行する培養条件を作出した。これまでにマウス生殖幹細胞株はGDNF、bFGFのシグナル存在下で体細胞型分裂周期による増殖を行うが両シグナルが生殖幹細胞株の減数分裂移行を抑制する事を見い出し、更に両因子の減数分裂抑制はレチノイン酸シグナルによって上位に抑制される事を明らかにした。この減数分裂の誘導過程はアポトーシスインヒビターの選択的使用もしくは誘導性shRNAレンチウィルスベクターを用いた特定のアポトーシス遺伝子の抑制により観察可能となった。生殖幹細胞のヒストンH3トリメチル化修飾、RNA pol II、RAR等のChIP-seq解析を進め、生殖幹細胞とES細胞の比較によりオープンなクロマチン修飾が両者で類似していること、生殖幹細胞のH3トリメチル化のbivalent修飾はES細胞と同様に初期発生過程で働く遺伝子群が占めること、RARは生殖幹細胞、ES細胞でターゲットが異なり生殖幹細胞では減数分裂遺伝子群に結合すること等を明らかにした。これらの結果を基に生殖幹細胞株の増殖分化転換のシグナル伝達経路と転写制御ネットワーク及びエピゲノム制御についてin silico解析、機能候補遺伝子群のcDNA発現、shRNAレンチウィルスベクターのライブラリを作成し表現型解析を進めている。またゲノム組換え制御及びクロマチン動態の制御に関わる事が示唆される2つ新規ノックアウトマウス系統の表現型解析を行い生殖細胞や幹細胞システム、初期発生過程における機能研究を進めた。
2: おおむね順調に進展している
本研究計画はプロテオーム、ChIP-seq 等を用いたdata driven型研究と個別の遺伝子/経路の分子生化学解析を用いて生殖幹細胞の減数分裂移行を規定する分子プログラム、生殖幹細胞の増殖分化転換に伴うクロマチン動態、生殖細胞の遺伝情報の恒常性制御、の理解を進めることを目的とする。本年度は減数分裂誘導に伴いRNA発現 やエピゲノム修飾が変化する遺伝子群をクラスタリングしシスエレメントのde novoモチーフ抽出を行い複数の機能候補因子を同定すると共に幾つかの候補遺伝子群について誘導性レンチウィルスベクターを用いたcDNA、shRNAの発現ベクターを構築し、生殖幹細胞株へtransductionと機能スクリーニングを進めた。その結果、幾つかの興味深い機能候補遺伝子群を得る事が出来た為、次年度引き続き詳細な解析を進める計画である。また低分子化合物を用いた小規模機能スクリーニングにより培養下における生殖幹細胞の減数分裂進行にゲノム損傷応答経路のチェックポイント機構が働く事を示唆する知見を得た。更に生殖幹細胞の減数分裂誘導過程の網羅的プロテオミクス解析を進めるに当たって安定同位体ラベルを用いた相対定量ショットガン解析を行う為の培養実験条件を詳細に検討し改良を進める事が出来た。またゲノム組換え制御及びクロマチン動態の制御に関わる事が示唆される2つの遺伝子の新規ノックアウトマウス系統の表現型解析を行い生殖細胞や幹細胞システム、個体発生過程における細胞、分子レベルの機能解析を進める事が出来た。研究計画はおおむね順調に進展している。
前年度に引き続き機能候補遺伝子群の機能スクリーニングを進めて生殖幹細胞の体細胞型増殖から減数分裂移行を制御する分子メカニズムを明らかにする事を目指す。特に減数分裂を特徴付ける最も初期の核動態の1つであるpre meiotic S期の開始に焦点を置き、体細胞分裂で共通する制御機構と減数分裂に特異的な分子経路が協調して働くクロストークを解明する。シグナル伝達分子と転写因子ネットワークについてアゴニスト、アンタゴニスト、遺伝機能獲得、RNA干渉実験等により各遺伝子の活性と表現型の有無、相互作用、エピスタシスなどを調べ、減数分裂の表現型検出には相同染色体対合を示すシナプトネマル複合体と組換え複合体の形成、未分化性維持は生殖幹細胞マーカーの消長、またFACSによる細胞周期解析、電子顕微鏡観察による微細構造観察等を指標とする。生殖幹細胞株の特徴の一つに生体精巣への細胞移植によって幹細胞型増殖、減数分裂を経て受精可能かつ個体発生に寄与する成熟配偶子を形成する点が挙げられる。上述の実験により得られた機能候補分子について生殖幹細胞株の精巣移植法を用いて生体における遺伝子機能獲得、抑制実験を行い、雄生殖細胞in vivo遺伝子導入系を併用する事で生理機能を調べる。また生殖細胞の遺伝情報の恒常性制御は他の幹細胞システムや分化細胞との比較によりゲノム損傷応答の特徴やDNA修復経路、チェックポイント応答について細胞生物学的、分子生化学的解析を進める。
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実験医学
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