受精を介した経世代エピゲノム変化の解明と制御

2015 年度 実績報告書

• 研究領域: 生殖細胞のエピゲノムダイナミクスとその制御
• 研究課題/領域番号: 25112007
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 伊川 正人 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (20304066)
• 研究期間 (年度): 2013-06-28 – 2018-03-31
• キーワード: ゲノム編集 / 生殖不全 / 遺伝子破壊 / 点変異 / 受精 / 不妊 / 精子 / 卵子

研究実績の概要

『目的』エピゲノム編集システムの開発とそれを応用した受精とエピゲノム変化の解析を2つの大きな柱にして研究を進める。サブテーマを設けて目標を明確にし、連携研究者4人を配置することで、リスクの軽減と問題の早期発見・解決を可能にする。
『実施概要』本研究では以下の２つを大きな柱にして研究を進めている。H27年度は、CRISPR/Cas9システムに注力して複雑なゲノム編集技術の開発を継続するとともに、精巣・卵巣・胎盤に特異的に発現する遺伝子のノックアウトマウスを作製して、受精とエピゲノム変化の解析を進めた。
1)CRISPR/Cas技術を用いたゲノム編集技術の開発：受精卵へのsgRNA/Cas9発現プラスミドと鋳型ssODNの注入により、FLAG, V5, His6などのタグ挿入を行った。またPpp3ccなどの解析対象遺伝子の酵素活性ドメインのアミノ酸置換なども実施した。得られたマウスの解析から、Tagと目的タンパク質の相互作用により検出効率が著しくことなること、また１アミノ酸置換でも目的タンパク質の安定性が顕著に低下することなどが明らかとなった。
2)受精とエピゲノム変化：これまでに作製した、精子形成不全や精子機能不全、受精障害などの不妊マウスを10系統以上について、表現型解析やメカニズム解析を進めた。H27年度は、卵子活性化に必須と考えられたPAWPが少なくともマウスでは不要であることを論文発表した。さらに精子カルシニューリン(PPP3CC/PPP3R2複合体)が、精子の中片部の屈曲性を制御していること、その阻害剤が男性避妊薬開発に繋がる可能性があることを示し、Science誌に発表した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

精子形成、受精、卵子活性化に異常をきたすノックアウトマウスを多数、作製できており、今後は解析に注力することで、予定どおりの成果を挙げることができる。論文報告をいくつか達成できている点から、おおむね順調と判断した。なお精子カルシニューリンが精子の成熟に必須であり、その阻害薬が男性避妊薬の開発に繋がることをScience誌に報告できたことは特筆できる。

今後の研究の推進方策

単純な遺伝子破壊と異なり、点変異やノックインなどの複雑な遺伝子改変を受精卵で行うことは難しい。そこでタグ挿入などは、処理数を増やすことのできるES細胞を活用するとともに、ES細胞の利点を活かしてキメラ動物での解析などを取り入れる。また精子カルシニューリンのように、男性避妊薬の標的となりえるものについては、共同研究などにより創薬の可能性を検討する。

研究成果

• [国際共同研究] Baylor College of Medicine(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Baylor College of Medicine
• [国際共同研究] University of Cambridge(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: University of Cambridge
• [国際共同研究] University of New Castle(Australia)
  • 国名: オーストラリア
  • 外国機関名: University of New Castle
• [国際共同研究] Seoul National University(韓国)
  • 国名: 韓国
  • 外国機関名: Seoul National University
• [雑誌論文] The Mg2+ transporter CNNM4 regulates sperm Ca2+ homeostasis and it is essential for reproduction. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki D, Miyata H, Funato Y, Fujihara Y, Ikawa M, Miki H.
  • 雑誌名: J Cell Sci. 巻: 129 ページ: 1940-1949
  • DOI: 10.1242/jcs.182220
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Lentiviral Vector-Mediated Complementation Restored Fetal Viability but Not Placental Hyperplasia in Plac1-Deficient Mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Muto M, Fujihara Y, Tobita T, Kiyozumi D, Ikawa M
  • 雑誌名: Biol Reprod. 巻: 94 ページ: 6
  • DOI: 10.1095/biolreprod.115.133454.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Elf5-centered transcription factor hub controls trophoblast stem cell self-renewal and differentiation through stoichiometry-sensitive shifts in target gene networks. (2015)
  • 著者名/発表者名: Latos PA, Sienerth AR, Murray A, Senner CE, Muto M, Ikawa M, Oxley D, Burge S, Cox BJ, Hemberger M
  • 雑誌名: Genes Dev. 巻: 29 ページ: 2435-2448
  • DOI: 10.1101/gad.268821.115.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Sperm calcineurin inhibition prevents mouse fertility with implications for male contraceptive. (2015)
  • 著者名/発表者名: Miyata H, Satouh Y, Mashiko D, Muto M, Nozawa K, Shiba K, Fujihara Y, Isotani A, Inaba K, Ikawa M
  • 雑誌名: Science. 巻: 350 ページ: 442-445
  • DOI: 10.1126/science.aad0836.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9-Mediated Rapid Generation of Multiple Mouse Lines Identified Ccdc63 as Essential for Spermiogenesis. (2015)
  • 著者名/発表者名: Young SA, Miyata H, Satouh Y, Kato H, Nozawa K, Isotani A, Aitken RJ, Baker MA, Ikawa M
  • 雑誌名: Int J Mol Sci. 巻: 16 ページ: 24732-24750
  • DOI: 10.3390/ijms161024732.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Sperm postacrosomal WW domain-binding protein is not required for mouse egg activation. (2015)
  • 著者名/発表者名: Satouh Y, Nozawa K, Ikawa M
  • 雑誌名: Biol Reprod. 巻: 93 ページ: 94
  • DOI: 10.1095/biolreprod.115.131441.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Calreticulin is required for development of the cumulus oocyte complex and female fertility. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tokuhiro K, Satouh Y, Nozawa K, Isotani A, Fujihara Y, Hirashima Y, Matsumura H, Takumi K, Miyano T, Okabe M, Benham AM, Ikawa M
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 5 ページ: 14254
  • DOI: 10.1038/srep14254.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A novel transcriptional factor Nkapl is a germ cell-specific suppressor of Notch signaling and is indispensable for spermatogenesis. (2015)
  • 著者名/発表者名: Okuda H, Kiuchi H, Takao T, Miyagawa Y, Tsujimura A, Nonomura N, Miyata H, Okabe M, Ikawa M, Kawakami Y, Goshima N, Wada M, Tanaka H
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 10 ページ: e0124293.
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0124293.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application for the study of reproduction (2016)
  • 著者名/発表者名: 伊川 正人
  • 学会等名: 国際シンポジウム "生殖細胞のエピゲノムダイナミクスとその制御"
  • 発表場所: 京都大学百周年時計台記念館 （京都府京都市）
  • 年月日: 2016-02-17 – 2016-02-19
  • 国際学会
• [学会発表] CRISPR/Cas9 mediated genome editing in mice (2016)
  • 著者名/発表者名: 伊川 正人
  • 学会等名: Lecture Series from Osaka University, Japan
  • 発表場所: バンドン工科大学（ITB)（インドネシア・バンドン）
  • 年月日: 2016-01-21 – 2016-01-21
  • 招待講演
• [学会発表] CRISPR/Cas-Mediated Genome Editing in Mice and Its Application for the Study of Reproduction (2015)
  • 著者名/発表者名: 伊川 正人
  • 学会等名: 第48回米国生殖学会会議（SSR 2015 Annual Meeting）
  • 発表場所: Puerto Rico Convention Center（プエルトリコ・サンファン）
  • 年月日: 2015-06-18 – 2015-06-22
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 遺伝子改変動物が導く受精メカニズムの新論争 (2015)
  • 著者名/発表者名: 伊川 正人
  • 学会等名: 第60回日本生殖医学会学術講演会・IFFS／JSRM International Meeting 2015
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • 年月日: 2015-04-26 – 2015-04-29
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会・シンポジウム開催] 国際シンポジウム "生殖細胞のエピゲノムダイナミクスとその制御" (2016)
  • 発表場所: 京都大学百周年時計台記念館 （京都府京都市）
  • 年月日: 2016-02-17 – 2016-02-19