計画研究
本研究では、始原生殖細胞(PGC)と多能性幹細胞の違いを生み出している遺伝子ネットワークの解析により、マウスのPGC形成機構を明らかにし、さらにその進化上の普遍性をいくつかのモデル生物を使って解明することを目的とする。これまでの研究で、転写因子のMaxやBrg1などの働きにより、マウスES細胞がPGCとしての性質を直接獲得することが阻害されることが明らかになっている。そこで、マウスES細胞においてと同様な機構が、プラナリア、ニワトリ胚、ゼブラフィッシュ胚でも保存されているかを調べた。前年度の結果を受けて、プラナリアでのMaxノックダウンの条件を検討した結果、6種類の生殖細胞特異的遺伝子が発現上昇傾向を示し、そのうちで2遺伝子については有意に発現が上昇していた。またBrg1のノックダウンでも同様の遺伝子の発現上昇傾向が見られたが、個体による発現のばらつきが、なお大きいと考えられた。またニワトリ初期胚の多能性幹細胞であるブラストダーム細胞を培養し、Maxのモルフォリノを導入してノックダウンを行うと、生殖細胞特異的に発現するCVH遺伝子を発現する細胞数の有意な増加が見られた。しかし予想に反して、モルフォリノが導入されている細胞の多くはCVH陰性で、周辺細胞でのMaxノックダウンが細胞非自律的に隣接細胞でのCVH遺伝子の発現を誘導している可能性が示唆された。一方で、Maxのノックダウン効率が悪いことがわかり、検討が必要であると考えられた。ゼブラフィッシュでは、64細胞胚から細胞株を樹立した。その細胞を標識後、初期胚へ移植してキメラ個体を作出し、その分化能を調べたところ、表皮、神経細胞、脊索、卵黄嚢表面の細胞へと分化することが認められ、この細胞株が外、中、内胚葉の細胞に分化しうる多能性を有していることがわかった。
2: おおむね順調に進展している
プラナリアとニワトリ胚で、ともにMax等のノックダウンによる生殖細胞遺伝子の発現誘導が示唆された。またゼブラフィッシュでは、三胚葉に分化する多能性細胞株が得られ、この細胞株を用いてMaxの生殖細胞関連遺伝子の発現抑制に果たす役割を解析できると考えられる。以上のような理由から、研究計画はおおむね順調に進んでいると判断できる。
生殖細胞遺伝子の発現抑制機構について、プライム多能性のマウスのエピブラスト細胞でもナイーブ多能性のマウスES細胞と同様に、生殖細胞特異的遺伝子がMaxにより抑制され、ヒストンH3K9のメチル化が起こっているかをしらべる。またプライム多能性であることが知られているヒトES細胞でMaxのノックダウンを行い、生殖細胞特異的遺伝子の発現誘導が起こるのかを調べる。プラナリアのMaxノックダウンでは、in situハイブリダイゼーションにより、生殖細胞遺伝子の発現変化の詳細を調べる。またBrg1ノックダウンでは、ノックダウンの期間等の条件を検討し、生殖細胞遺伝子の発現誘導条件の最適化を試みる。ニワトリ初期胚細胞でのノックダウンは、モルフォリノの導入方法などのノックダウン条件の最適化を試みる。さらにゼブラフィッシュにつては、樹立した64細胞胚由来細胞株においてMax遺伝子ノックダウン実験を進め、生殖系列遺伝子（vas, dazl, dnd1, nanos3, ziwi等）の発現量を解析する。さらに、Max関連遺伝子のBrg1についても同様の解析を進めるとともに、その結果を初期胚のノックダウン実験により検証する。
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