| 研究領域 | 動物における配偶子産生システムの制御 |
|---|
| 研究課題/領域番号 |
25114008
|
|---|
| 研究機関 | 東京農業大学 |
|---|
研究代表者 |
尾畑 やよい 東京農業大学, 応用生物科学部, 准教授 (70312907)
|
|---|
| 研究分担者 |
平尾 雄二 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, その他部局等, 研究員 (10355349)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-06-28 – 2018-03-31
|
| キーワード | 卵母細胞 / インプリント / 卵母細胞形成 / 体外培養 |
|---|
| 研究実績の概要 |
in vitroにおいて卵を産生する新規技術開発を目的として平成26年度は、下記の研究を行った。
1）卵形成過程における遺伝子発現プロファイルを構築することを目的として、各成長ステージのマウス卵母細胞のRNA-seq解析を行った。クラスタリング解析の結果、非成長期卵母細胞（ng卵）は他の卵母細胞よりES細胞に近いこと、成長期卵母細胞はどの時期のものも比較的似ていることが明らかとなった（投稿準備中）。一方、in vivoとin vitro由来卵母細胞の比較では、ng卵で有意に発現量が変化する遺伝子群を見いだした。
2）マウスng卵から産仔まで発生可能な成熟卵をin vitroで産生するために、培養10日目までは器官培養、培養10日から24日目までは平成25年度に開発したin vitro growth法で実施した。器官培養の培地について、代替血清等の添加物について検討したところ、10%ウシ胎児血清、低グルコース（1g/L）、高分子化合物無添加の条件が二次卵胞の回収を有意に向上させた。これらをin vitro growthに供試し発生能を解析した結果、既報を大幅に上回り7%が産仔へと発生した（投稿準備中）。
3）インプリント機構は生殖細胞に不可欠な機構であるが、詳細は不明である。インプリント機構解明を目的に、DNAメチル化がインプリントに果たす役割を明らかにした。メチル化インプリントを保持する成熟卵から作出された受精卵では、受精後インプリントは維持され、遺伝子発現制御に機能するのに対し、成長期卵母細胞から作出された受精卵では、卵母細胞ゲノムでメチル化インプリントが完了しているにもかかわらず、受精後の発生過程で脱メチル化を受け、胚の遺伝子発現制御に破綻をきたすことが明らかとなった。卵のインプリントはDNAメチル化のみでは不十分でメチル化を保持するための機構が存在することが明らかとなった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
研究分担者との連携が良好で、「in vitro培養系の開発」および「卵のインプリント機構解明」については当初の計画以上に研究が進んだ。非成長期卵母細胞から産仔へと発生可能な成熟卵をin vitroで産生した報告は20年前に1報存在するが、それ以来再現されていなかった。平成26年度は、非成長期卵からin vitroで成熟卵の産生に成功したのみならず、既報を大きく上回る成功率となり、学会発表することができた。現在、投稿を準備している。この成果により、最終目標とする「始原生殖細胞からin vitroで卵を産生する新規技術の開発」に大幅に近づき、この培養系の開発においても良好な結果が得られ始めている。また、インプリント機構を解析する過程で、卵のインプリントにはDNAメチル化を保持する分子機構が必要であるという新たな知見が得られた、その成果を1報の論文に発表することができた。
「卵母細胞成熟マーカーの探索」のためのRNA-seq解析についても、平成25年度に行えなかった研究と平成26年度に行う予定の研究の両者が完了しおおむね順調といえる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
in vitroにおいて卵を産生する新規技術開発を目的として平成27年度は、引き続き、1）卵母細胞成熟マーカーの探索、2）in vitro培養系の開発、および3）卵のインプリント機構解明の研究を進める。
1）卵母細胞成熟マーカーの探査 in vivoおよびin vitro由来の各成長ステージの卵母細胞におけるRNA-seq解析の結果を比較解析し、卵の機能を左右しうる遺伝子やインプリントに寄与する可能性のあるエピジェネティック関連候補因子の抽出を試みる。また、平成26年度明らかにされた、非成長期卵母細胞においてin vivoとin vitroの由来により差次的発現を呈した遺伝子群については、減数分裂、卵胞形成、細胞死など卵形成イベントに関連するか否か、Pathway解析などを駆使して解析すると共に、選出された候補因子は経時的あるいは細胞特異的な遺伝子発現解析や免疫染色解析を実施することで、卵形成のマーカーを選出する。
2）in vitro培養系の開発 最終目標とする「始原生殖細胞からin vitroで卵を産生する新規技術の開発」は国内外を通じて成功例がない。平成25・26年度に構築したin vitro系をさらに発展させるため、マウス胎仔由来の始原生殖細胞より個体発生可能な成熟卵の産生を試みる。培養条件として、血清、代替血清、成長因子などの添加を検討し最適な培養条件の確立を目指す。
3）卵のインプリント機構解明 卵で確立したDNAメチル化インプリントを維持する為には別のエピジェネティック修飾が必要なことが平成26年度明らかにされた。そこで、DNAメチル化維持に寄与するエピジェネティック候補遺伝子を1）のRNA-seqデータから選別し、その発現解析を実施する。選別にあたって、既報の事実をもとH3K9me2などの修飾酵素やZFPタンパク質に着目する。
|
| 備考 |
現在、準備中です。
|
