| 研究領域 | 動的クロマチン構造と機能 |
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| 研究課題/領域番号 |
25116006
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| 研究機関 | 独立行政法人情報通信研究機構 |
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研究代表者 |
原口 徳子 独立行政法人情報通信研究機構, 未来ICT研究所, 上席研究員 (20359079)
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| 研究分担者 |
淺川 東彦 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (70399533)
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| 研究期間 (年度) |
2013-06-28 – 2018-03-31
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| キーワード | 細胞・組織 / 細胞核 / クロマチン / 細胞構造 / タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
細胞増殖や発生過程におけるクロマチン機能を保証する核膜の構造とその分子基盤を明らかにすることを目的とする。本年度は３項目に関して研究を行い、以下の成果を得た。
１）人工ビーズを用いたクロマチン機能に必要な核膜因子の同定： DNAビーズに蛍光色素pHrodoを結合させ、その蛍光の消失から、cytosolに入った瞬間を可視化することに成功した。この方法を使うと、生きた細胞で、望みのDNAビーズが細胞質に入った瞬間を知ることが可能となり、核膜集合あるいはオートファジー膜集合までの時間を正確に測定することが可能になった。DNAビーズを細胞内に導入した際に形成される核膜様の膜構造には、核膜タンパク質エメリンも含まれる。昨年度の解析から、核膜には、オートファジー膜集合を阻害する働きがあることが分かっていたが、今年度は、エメリンには、オートファジー膜を排除する能力がないことを明らかにした。
２）天然微小核を用いたクロマチン機能を保証する核膜因子の解明： 天然に形成された微小核として、ヒト骨肉腫細胞のU2OS細胞で高頻度に見られる微小核構造を、生細胞蛍光イメージング法を用いて、NLS-GFPで核タンパク質を可視化した細胞で微小核の挙動を可視化したところ、微小核の核膜の一部が破裂して核タンパク質が細胞質に流出することが分かった。
３）進化的に保存された核膜タンパク質のクロマチン機能に果たす役割の解明：ヌクレオポリンが生殖細胞形成に果たす役割を解析した。Nup132の欠質によって減数分裂期染色体の分配に異常がでる原因について蛍光イメージング法を用いて検討し、第一減数分裂期のセントロメアのouter kinetochoreに存在するタンパク質群が、正常な時期にセントロメアに局在するのにNup132が必要であることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）人工ビーズを用いたクロマチン機能に必要な核膜因子の同定：今年度は、DNAビーズの周辺に形成されるBAF依存的な核膜形成には、核膜タンパク質エメリンは関与しないことを明らかにした。また、DNAビーズが、エンドソームから細胞質内に入った瞬間を可視化する実験系を確立した。これにより、DNAビーズの細胞内での動態を生きた細胞で観察することが可能となった。これらの成果は今後の展開に重要であり、順調に進展しているといえる。
２）天然微小核を用いたクロマチン機能を保証する核膜因子の解明：微小核構造と機能の関係を知るためには、生きた細胞で微小核の機能を知る方法が必要である。今年度は、生細胞蛍光イメージング法を用いて、NLS-GFPで核タンパク質を可視化した細胞を作成し、その結果、微小核の持つ能力、すなわち核タンパク質を保持する能力の有無を可視化することに成功した。その結果、微小核の核膜の一部が破裂して核タンパク質が細胞質に流出することが分かった。
３）進化的に保存された核膜タンパク質のクロマチン機能に果たす役割の解明：今年度は、ヌクレオポリンが生殖細胞形成に果たす役割を解析した。Nup132の欠質によって減数分裂期染色体の分配に異常がでる原因について蛍光イメージング法を用いて検討し、第一減数分裂期のセントロメアのouter kinetochoreに存在するタンパク質群が、正常な時期にセントロメアに局在するのにNup132が必要であることを明らかにした。さらに、核膜タンパク質LEM2の機能についても解析を進めている。
すべての項目で、目標を達成しており、関連の論文の発表準備も進んでいることから順調に進展しているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
人工ビーズを用いたクロマチン機能に必要な核膜因子の同定では、 DNAビーズだけでなく、目的タンパク質をビーズ上に結合させる方法を開発する。可能ならば、結合量や結合方向（N末端かC末端か）を任意に選ぶことができる方法を開発したい。それによって、目的タンパク質を思い通りに選び、量・質というさまざまな条件で、目的タンパク質の機能を調べることができるようになる。細胞質内にビーズを入れるには、エンドソーム膜を破る必要がある。エンドソーム膜を効率よく、あるいは目的のビーズに対して思い通りの時間に破る方法を開発したい。
天然微小核を用いた解析では、蛍光生細胞イメージング法とRNAiによるノックダウンを使って、微小核の維持に働く核膜因子を同定する。そのターゲットとなるタンパク質を選定するために、微小核で有意に減少している因子に着目して研究を進める予定である。
進化的に保存された核膜タンパク質としてLEM2、bqt4、Nup98、Nup132などに着目し、核膜タンパク質とクロマチン機能・構造との関連を、遺伝学と蛍光イメージング法あるいは電子顕微鏡法を用いて明らかにする。特に、目的タンパク質の変異体と野生株のミニ染色体の脱落頻度を比較することによって、核膜タンパク質のセントロメア機能について明らかにしたい。
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