計画研究
生後発達早期のマウス大脳皮質の感覚野と小脳皮質を扱い、技術的には二光子顕微鏡法と電気生理学的手法を用いたシナプスリモデリングの評価を行った。平成27年度には大脳皮質では脳透明化手法を用いた複数のグリア細胞種の空間配置の解析を実施し、また電子顕微鏡によるグリアとシナプスの相互関係の定量を実施した。また小脳においてはミクログリア欠損が刈り込みに与える影響についてさらに解析を推し進めた。（1）大脳皮質：二光子顕微鏡による体性感覚野のイメージングと脳透明化手法であるCLARITYを組み合わせた解析を前年度に引き続き行った。脳の透明化手法によりミクログリアの占有体積を前年度に計測できたので、今年度はアストログリアの空間配置について検討した。アストログリアの大脳皮質内での占有体積はミクログリアよりも小さいが、ミクログリアと同様にその配置は相互に排他的であった。両者の相互関係についてはこのような排他性が存在せず、両者は皮質内でほぼランダムに存在しているというモデルで説明が可能である。以上の結果は大脳皮質内がミクログリアとアストログリアの配置により二種類の細胞の影響の異なる複数の領域に分割されることを示唆する。また電子顕微鏡によるアストログリアとシナプスの接触の解析については生後早期と成熟期における比較を終了し、アストログリアの体積増加によるシナプスとの物理的接触の増加によって二つの時期のアストログリアによるシナプス接触率の増大が説明できることを示した。（2）小脳皮質：生後発達期小脳にクロドロン酸内包リポソームの局所注入を用いてミクログリアを除去する実験を行った処、登上線維刈り込みの障害が起こることがわかった。さらに、よりミクログリア特異的な実験操作を目的として作成を進めていたCSF1rミクログリア特異的欠損マウスの作出に成功し、予備実験から登上線維の刈り込みの異常を示す所見が得られた。
2: おおむね順調に進展している
平成27年度までの研究により、大脳皮質、小脳皮質のいずれの部位においてもグリア細胞、特にミクログリアのシナプスリモデリングに与える影響に着目して研究が進められ、興味深いデータが得られつつある。これまでの研究の達成度はほぼ予定通りであると考えている。平成28年度は更にシナプスの形成・除去に対するミクログリアの役割という観点から個体レベルの研究および分子機構の解明について推進する。（１）大脳皮質：前年度までの研究により、a）生後2-3週の体性感覚野でのシナプスの形成・除去に対するミクログリアの影響のイメージングによる評価、b) 複数の自閉症モデル動物における大脳皮質シナプスの形成・除去の亢進、c) 二光子顕微鏡によるシナプスの個体レベルでのイメージングと脳透明化手法CLARITYを組み合わせる事によるミクログリア・アストログリアとシナプスの関係性についての新しい評価方法の確立 という三つの項目について着実な成果が得られている。28年度は更に大脳皮質内の複数のグリア細胞種がシナプスへの影響を制御する分子シグナルについての研究を継続する。（２）小脳皮質： 昨年度までのミノサイクリン投与実験、クロドロン酸内包リポソーム投与実験の結果は、共通してミクログリアがシナプス刈り込みに機能的に関与していることを示唆する結果となった。複数の異なる実験アプローチから同様な結果が得られたことにより、ミクログリアのシナプス刈り込みへの関与をより確実なものとして確認することを得た。また昨年度は、上記実験には薬剤の特異性や投与方法に問題があったため、よりミクログリア特異的な実験操作を目指して作出を進めていたCsf1rミクログリア特異的欠損マウスの作出にも成功した。よってほぼ計画通りに研究は進行していると考えている。
上記の様に、ほぼ計画通りに大脳皮質および小脳皮質での研究が進展している事から、平成28年度は、特に以下の2項目に重点を置いて研究を行う（１）大脳皮質：これまでに、生後発達期での選択的なシナプスの保持と除去の進行についての基本的データを取得し、自閉症モデル動物との比較も終了した。二光子顕微鏡によるシナプスの個体レベルでのイメージングと脳透明化手法CLARITYを組み合わせた実験については28年度も継続して実施し、複数のグリア細胞の配置によって大脳皮質内が異なったドメインに分割され、そのドメイン内のシナプスが異なった制御を受けている可能性を検討する。更に本年度は27年度にデータ取得を終えた電子顕微鏡によるグリア突起とシナプスの関係性についての網羅的解析を元にして、二光子シナプスイメージングを行ったサンプルについて同じシナプスを電子顕微鏡により解析してシナプス動態とグリア接触の関係性を明らかにする事を試みる。（２）小脳皮質：本年度は、昨年度までの解析により作出したCsf1rミクログリア特異的欠損マウスの解析を中心に行う予定である。シナプス刈り込み障害の所見は得られたので、さらに生後発達過程を詳細に解析し、発達時期特異性について明らかにする。また、登上線維の刈り込みに影響を与える平行線維シナプス・抑制性シナプスの形態やシナプス伝達の特性を解析し、ミクログリア特異的な刈り込みの機序について解析を推し進める。また、組み換えマウスにおけるアストロサイトやオリゴデンドロサイトの染色実験を通じて形態や発達に与える影響について解析し、グリアアセンブリがシナプス刈り込みに与える影響についても解析する予定である。
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