| 研究領域 | グリアアセンブリによる脳機能発現の制御と病態 |
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| 研究課題/領域番号 |
25117013
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
井上 和秀 九州大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (80124379)
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| 研究分担者 |
津田 誠 九州大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (40373394)
齊藤 秀俊 九州大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (90444794)
増田 隆博 九州大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (80615287)
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| 研究期間 (年度) |
2013-06-28 – 2018-03-31
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| キーワード | ミクログリア / 神経障害性疼痛 / 発達障害 / シナプスリモデリング / in vivoイメージング |
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| 研究実績の概要 |
シナプスリモデリングに重要とされるミクログリアの形態変化、突起運動などを観察可能な遺伝子改変マウス（CX3CR1-GFP）と、神経細胞の樹状突起上のスパイン構造を観察可能な遺伝子改変マウス（Thy1-YFPH）の両表現型を持つ遺伝子改変マウスを作製し、神経障害性疼痛モデルマウスにおいて、体性感覚野の同一個体の同一のミクログリアにつき神経傷害前の２～３日間と神経傷害後の7日間、継続的に観察し、神経傷害後にミクログリアの移動能が亢進傾向にあることを明らかにした。また、ミクログリアの活性化応答・運動機能の発現に関与するIRF8を時期特異的・ミクログリア特異的にノックダウンする遺伝子改変マウス（floxed-IRF8, CX3CR1-creER）、ならびにミクログリアの貪食能に関与するP2Y6受容体欠損マウスのミクログリアを可視化した遺伝子改変マウス(P2Y6KO, CX3CR1-GFP)をそれぞれ作成し、IRF8およびP2Y6の機能解析を開始した。一方で、脊髄実質のイメージングを可能にするチャンバーを設計・構築し、アデノ随伴ウイルスベクターを用いてアストロサイトの細胞内カルシウム応答をライブイメージングする系を構築した。これを用いて、脊髄後角1,2層のアストロサイトは末梢一次求心性神経からの各種侵害刺激に応答すること、さらに、この伝達系にTRPV1陽性神経、ならびにIP3受容体IP3R2が関与することを世界で初めて明らかにした。加えて、発達障害モデルとして、胎児期バルプロ酸暴露モデル、胎児期母体炎症モデルを作成し、幼弱期隔離マウスでは疼痛レベルの増悪を、バルプロ酸暴露モデルでは神経障害性疼痛の維持期に疼痛の減弱が見られることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
生きたままの個体でミクログリアと神経細胞の同時観察可能なマウスを作成し、神経障害性疼痛モデル動物の経日変化を同一の細胞で観察できる点においては動物の供給体制が整えば、安定したデータ取得が予想される。ミクログリア関連遺伝子欠損マウスにおいても生体イメージングを目的とした動物の交配が問題なく進んでいる。遺伝子改変動物の交配によることなくミクログリアの遺伝子発現制御を可能にするために、レンチウイルスベクターによる発現系の構築を行っているが、ミクログリア選択的に蛍光タンパク質を発現させるプロモーター配列を得ており、今後はこれを利用してベクター投与によるミクログリアの機能制御・機能観察が可能になると予想される。ミクログリア特異的に遺伝子改変を行う新たなツールとしてCX3CR1-creERマウスを導入し、ミクログリアの機能に関連する遺伝子（IRF8、Mafb）のFloxedマウスと交配を進めてきており、実験に使用できる遺伝型を持つマウスを得ることができてきた。今後はこれらのマウスを用いてミクログリアの機能を変化させたときに起こる個体レベルの変化を解析することができる。
脳神経系のみならず脊髄神経系におけるグリア細胞のライブイメージング法を構築する過程で、これまでに一般化されてきたアデノ随伴ウイルスによるアストロサイトへの遺伝導入技術を組み合わせ、アストロサイトの細胞内カルシウム応答を末梢への刺激に対して観察できるようになったことは、これまでほとんど観察されてこなかった脊髄での神経-アストロサイト間シグナル伝達研究を促進すると思われる。同時に開発中のミクログリアへの遺伝子発現ベクターを脊髄組織へ最適化することにより、ミクログリア、アストロサイト、神経のネットワークを、感覚情報伝達の観点で追究できると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
ミクログリアと神経細胞を可視化したマウス（CX3CR1-EGFPとThy1-EYFPの表現型）と二光子励起顕微鏡を用いて神経突起の微細構造とミクログリアの突起の微細構造の間にどのような相互作用が観察されるか、感覚情報の入力時、疼痛時、にどのような相互作用が引き起こされるかについて解析を行う。この解析の中で、プリズムミラーを用いた深部前頭前野・前帯状回イメージング、グリア長期イメージング用プロトコルを用いた体性感覚野イメージング、独自に設計した生体インプラントチャンバーを利用した脊髄イメージング手法を用いてミクログリア、またはアストロサイトについてin vivoレベルでイメージングする。さらに、ミクログリア・アストロサイトにGCaMP6（カルシウム応答性傾向プローブ）を発現させたマウスも作成し（必要なマウス系統は取得済）、ミクログリア・アストロサイトの細胞内カルシウム動態と様々なストレス状態（疼痛、社会的敗北ストレス、母体炎症）でのミクログリア・アストロサイトの挙動と神経細胞構造への影響を観察する。また、技術支援班から提供される逆行性ベクターを用いて、特定神経回路（一次体性感覚野と前帯状回、視床、扁桃体など）を可視化し、疼痛やストレス負荷時のミクログリア・アストロサイトのイメージングを行う。脊髄イメージング法を用いた解析においては、末梢からの感覚情報を受け取っている脊髄後角アストロサイトのカルシウム応答を観察し、グリアー神経間シグナル分子の実態を解析する。
ウイルスベクターを用いて大脳皮質ミクログリアに骨格制御分子阻害タンパクを発現させ突起運動の制御技術を確立する。また、また作成した各種遺伝子改変マウスを用い、ミクログリア機能制御動物の行動性をCrawley's 社会性テストや繰り返し社会的敗北ストレスモデルにおける社会性行動変化を評価する。
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