| 研究領域 | ノンコーディングRNAネオタクソノミ |
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| 研究課題/領域番号 |
26113007
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
泊 幸秀 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (90447368)
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| 研究分担者 |
多田隈 尚史 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (10339707)
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| 研究期間 (年度) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| キーワード | RISC / Argonaute / 一分子イメージング / small RNA |
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| 研究実績の概要 |
前年度に成功した、ショウジョウバエのAgo2をモデルとしたRISC形成過程および標的切断過程の一分子観察をさらに展開するため、今年度はRNAだけではなくタンパク質を蛍光標識する手法の検討を行った。その結果、RISC積み込み複合体(RISC-loading complex; RLC)の構成成分であるDicer-2およびR2D2それぞれのタンパク質を、昆虫細胞を用いてHaloタグ付きで発現させ、Haloリガンドを介して蛍光色素を導入した後に精製することに成功した。これによって、大腸菌などでは発現精製が困難なnon-coding RNAに関わる任意のタンパク質に対して、蛍光色素を導入する汎用的な手法の確立に道筋がついた。
さらに、上記手法を用いて蛍光色素を導入したDicer-2/R2D2ヘテロダイマーに対し、すでに確立した手法に基づき、Hsp40, Hsc70, Hop, Hsp90, p23というシャペロン因子群を加え、RISC形成を再構成することによって、蛍光標識したDicer-2/R2D2と蛍光色素したsiRNAが、基板上に固定したAgo2と相互作用する様子を一分子イメージングを用いてリアルタイムで観察することに成功した。また、一分子イメージングに用いる顕微鏡の増強および最適化を行い、ハイスループットで一分子観察を行うことのできる環境を整えた。
また、これまで生化学的な解析を進めてきたpiRNAの生合成過程について、piRNA前駆体の3'末端を削り込んで成熟化させるエクソヌクレアーゼTrimmerの同定と機能解析を行い、Cell誌に報告した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
大腸菌などでは発現精製が困難なタンパク質を、Haloタグを付加した形で昆虫細胞を用いて発現し、Haloリガンドを介して蛍光色素を導入したあと、当該タンパク質を生成するという手法に成功したことによって、non-coding RNA作動装置形成の汎用的な一分子イメージングに道筋を付けることができた。また、蛍光を導入したタンパク質を用いて、実際のRISC形成過程を再構成できたことは、今後の解析に向けて大きな前進である。さらに、piRNAの前駆体を削り込む酵素Trimmerの同定にも成功し、研究全体としては当初計画以上に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、蛍光色素を導入したタンパク質と、別の蛍光色素を導入したnon-coding RNAとの間のFRETを観察できる実験系の開発を行い、non-coding RNA作動装置形成過程における分子間相互作用やその距離を解析できる体制を整えたい。また、これまでに確立したRISC形成および標的切断過程の一分子イメージングを活用し、ウイルスが持つRNAサイレンシングサプレッサータンパク質がRISCの機能に与える影響を一分子レベルで解析する試みを進めて行きたい。
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