• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2016 年度 実績報告書

ncRNA作動装置構築の分子動態解析基盤の開発

計画研究

研究領域ノンコーディングRNAネオタクソノミ
研究課題/領域番号 26113007
研究機関東京大学

研究代表者

泊 幸秀  東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (90447368)

研究分担者 多田隈 尚史  大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (10339707)
研究期間 (年度) 2014-07-10 – 2019-03-31
キーワードArgonaute / RISC / 一分子イメージング / small RNA
研究実績の概要

前年度に確立した、昆虫細胞を用いてnon-coding RNA関連タンパク質因子を発現させ、蛍光色素を導入して精製する手法を活用し、蛍光色素で標識したArgonauteタンパク質や、Dicer-2/R2D2ヘテロダイマーなどを十分な量および精製度で調整することに成功し、これらを用いた各種経路の一分子解析系の構築を進めた。また、Argonauteタンパク質に2色の蛍光色素を導入し、その蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を観察することで、構造変化を追跡する実験系の開発に着手した。この目的のためには、これまで用いてきたHaloあるいはSNAPタグを用いた蛍光色素導入法では限界があるため、システイン残基を利用した古典的な蛍光色素導入法に加え、非天然アミノ酸の部位特異的導入法やin vitroでのタンパク質合成系など、様々な方法を比較検討し、効率よく蛍光色素を導入できる手法の開発を進めた。
また、すでに確立したRISCによる標的切断過程の一分子イメージング系を用い、様々なウィルスが持つサイレンシングサプレッサータンパク質が標的切断過程を阻害する様式を詳細に解析した。具体的には、フロックハウスウイルスのB2タンパク質、ショウジョウバエCウイルスの1Aタンパク質、コオロギ麻痺ウイルスの1Aタンパク質をリコンビナントタンパク質として調製し、ショウジョウバエAgo2-RISCによる標的RNA切断の一分子イメージング系に導入した後、全反射顕微鏡を用いてその様子をリアルタイムでモニターすることに成功した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

蛍光色素を導入した各種タンパク質を用いた一分子イメージングを安定的に行える体制がととのったことにより、現在焦点を当てている小分子RNA経路の解析が今後順調に進むことが予想されるとともに、他のnon-coding RNA作動装置の一分子イメージングに対象を広げることが可能であることを意味している。また、1つのタンパク質に複数の蛍光色素を導入する手法の検討においては良好な予備データを得ており、今後、各種non-conding RNA関連タンパク質の構造変化をモニターできる系の構築に向けて期待できる。さらには、ウイルスがもつサイレンシングサプレッサータンパク質の詳細な一分子イメージング解析にも成功しており、研究全体としては概ね順調に進展していると考えられる。

今後の研究の推進方策

引き続き、蛍光色素を導入したArgonauteタンパク質や、Dicer-2/R2D2ヘテロダイマーなどを用いた小分子RNA経路の一分子解析を積極的に進め、生化学では難しい分子メカニズムの解明に迫りたいと考えている。また、Zero-Mode Waveguide (ZMW)を含めた一分子イメージングの系そのものの改良を進め、解析対象となりうる分子や濃度範囲の幅を広げることにより、領域で扱われている様々なnon-coding RNAの一分子解析に資する体制を整えたい。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 謝辞記載あり 2件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 3件、 招待講演 3件)

  • [雑誌論文] The poly(A) tail blocks RDR6 from converting self mRNAs into substrates for gene silencing.2017

    • 著者名/発表者名
      Baeg K, *Iwakawa HO, *Tomari Y.
    • 雑誌名

      Nature Plants

      巻: 3 ページ: 17036

    • DOI

      10.1038/nplants.2017.36.

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Codon usage and 3′ UTR length determine maternal mRNA stability in zebrafish2016

    • 著者名/発表者名
      Mishima Y, Tomari Y
    • 雑誌名

      Mol Cell

      巻: 61 ページ: 874-85

    • DOI

      10.1016/j.molcel.2016.02.027

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Dissection of RISC assembly and function by single-molecule imaging2016

    • 著者名/発表者名
      泊 幸秀
    • 学会等名
      8th International Conference on the Hsp90 Chaperone Machine
    • 発表場所
      Seeon Abbey, Germany
    • 年月日
      2016-11-02 – 2016-11-06
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Surveillance of aberrant mRNAs by plant RDR62016

    • 著者名/発表者名
      泊 幸秀
    • 学会等名
      The Complex Life of mRNA
    • 発表場所
      EMBL Heidelberg, Germany
    • 年月日
      2016-10-05 – 2016-10-08
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] A clade of plant AGO proteins prefer to bind DNA (rather than RNA) targets2016

    • 著者名/発表者名
      泊 幸秀
    • 学会等名
      Regulatory & Non-Cording RNAs
    • 発表場所
      Cold Spring Harbor Laboratory, NY, USA
    • 年月日
      2016-08-23 – 2016-08-27
    • 国際学会 / 招待講演

URL: 

公開日: 2018-01-16  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi