| 研究領域 | 新生鎖の生物学 |
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| 研究課題/領域番号 |
26116002
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
田口 英樹 東京工業大学, 大学院生命理工学研究科, 教授 (40272710)
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| 研究分担者 |
今高 寛晃 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (50201942)
富田 野乃 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 准教授 (80323450)
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| 研究期間 (年度) |
2014-07-10 – 2019-03-31
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| キーワード | 新生鎖 / フォールディング / シャペロン / 翻訳 / リボソーム |
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| 研究実績の概要 |
26年度は、私たちが礎を築いた新生鎖の生物学に関するユニークな実験系を元に新生鎖フォールディングの分子機構・シャペロンの役割を解明、さらに、真核生物PUREシステムを完成させて一層の研究展開を図った。
１．新生鎖フォールディングの分子機構：新生鎖フォールディングを助ける Hsp70（DnaK）やシャペロニン（GroEL/Hsp60）などのシャペロンは翻訳されてくる蛋白質に応じて、連携したり、単独で働いたりしているらしい。特に、複数種のシャペロンがどのような連携機構で新生鎖フォールディングを助けているのか不明である。そこで、種々のシャペロンが新生鎖のフォールディングをどのように助けているのかを大腸菌の再構築型無細胞翻訳系（PUREシステム）を使った生化学、遺伝学的に当該シャペロンを欠損もしくは条件欠乏させた大腸菌で解析した。
２．大規模な翻訳速度調節アッセイ： 翻訳の一時停止（翻訳アレスト）を含めた翻訳速度調節とフォールディングが関連していることがわかってきた。その手始めとして、大腸菌をモデル生物として、大規模に翻訳一時停止アッセイを行った。
３．真核生物の再構築型無細胞翻訳系（真核PUREシステム）：（今高）真核細胞、特にヒト細胞における新生鎖の研究を行うための研究基盤として、ヒト因子由来再構成型翻訳システムを樹立した。（富田-竹内）出芽酵母因子由来の再構築型無細胞翻訳系の完成をめざした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初目標に掲げた研究計画について以下のような進展があったので、おおむね順調に研究が進んでいると判断した。
１．新生鎖フォールディングの分子機構： 大腸菌のHsp70ファミリーであるDnaKの欠損株にてシャペロニンGroELの基質蛋白質を発現させて、そのフォールディングがDnaK欠損株で影響を受けるかどうか解析した。DnaK欠損株ではフォールディングに影響がなければ、その蛋白質はGroELには依存するが、DnaKには依存しないこと、DnaK欠損株でGroEL基質蛋白質がフォールディングに失敗して凝集もしくは分解されれば、その蛋白質はDnaKとGroEL両方に依存することがわかる（「GroEL＆DnaK基質」）。GroELの基質蛋白質数十種類をDnaK欠損株で発現させたところ、約半数がGroEL＆DnaK基質であることが判明した。シャペロンの基質蛋白質について、GroELやDnaKなど個別には明らかとなってきているが、その連携について新たな知見を得た。
２．大規模な翻訳速度調節アッセイ：大腸菌で、細胞内およびPUREシステムを用いて、1000種類以上の遺伝子（ORF）を発現させ、翻訳途上産物であるペプチジルtRNA（新生鎖）が蓄積するかどうかを電気泳動で逐一調べて、一時停止の状況を評価した。
３．真核生物の再構築型無細胞翻訳系（真核PUREシステム）：（今高）翻訳伸長因子、翻訳終結因子、リボソーム、tRNA（すべてヒト由来）だけでタンパク質合成ができるシステムを樹立した。このシステムを用いて、脳心筋炎ウイルスの2Aペプチドによる翻訳終結・再開始が翻訳開始因子や終結因子そして特別な因子無しで起こることを証明した（JBC 2014 289:31960）。（富田-竹内）精製した出芽酵母の翻訳因子を使い、翻訳開始過程をスキップした条件にて翻訳系を再構成することに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．新生鎖フォールディングの分子機構： これまでにDnaKやGroELが新生鎖フォールディングにどう影響するのか調べてきたが、新生鎖に関わるシャペロンとしてTrigger Factor、さらにはLonなどのATP依存プロテアーゼも関係する。そこで、27年度は、PUREシステムを用いて、新生鎖フォールディングの再構成を目指す。また、その再構成系を使った1分子解析も行いたい。
２．大規模な翻訳速度調節アッセイ：大腸菌で、細胞内およびPUREシステムを用いて、1000種類以上の遺伝子（ORF）を発現させ、翻訳途上産物であるペプチジルtRNA（新生鎖）の蓄積、すなわち、翻訳一時停止の状況を評価したので、その結果を生物情報学的に分析し、生物学的に重要な情報を抽出する。
３．真核生物の再構築型無細胞翻訳系（真核PUREシステム）：（今高）ヒトシャペロン（CCT, PFD, HSPs, RAC, NAC等）を添加した再構成型翻訳システムを完成させる。そしてこのシステムを用いて、ヒトタンパク質新生鎖、特に神経疾患に関連するタンパク質の新生鎖のフォールデイングにどのようなシャペロンが関与しているか、を研究する。（富田-竹内）出芽酵母にてスキップした翻訳開始過程を含めた翻訳系の再構成を目指す。
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