新生鎖の立体構造形成を支えるジスルフィド形成システムの解明

2017 年度 実績報告書

• 研究領域: 新生鎖の生物学
• 研究課題/領域番号: 26116005
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 稲葉 謙次 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (10423039)
• 研究分担者: 門倉 広 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (70224558)
• 研究期間 (年度): 2014-07-10 – 2019-03-31
• キーワード: タンパク質品質管理 / ジスルフィド結合 / X線結晶構造解析

研究実績の概要

C7抗体は立体構造形成特異的な抗体であり、LDL受容体(LDLR)のN末端に存在するR1ドメインに、天然型のジスルフィド結合が形成されるとこれを認識する。平成29年度には、C7抗体とジスルフィド結合形成モニタリング系を利用した解析を推し進め、新生鎖が80kDaの大きさに伸長すると、R1ドメイン中のジスルフィド結合が非天然型のものから天然型のものに組み換えられることを見出した。更に、この反応にはR1ドメインの下流に存在するβプロペラ領域が必要であることも分かった。よって、R1ドメインの立体構造形成反応は、下流に存在するドメインの翻訳合成で制御されていることが強く示唆された。更に、河野班との共同研究により、小胞体ストレスセンサーIRE1αが、膵臓ランゲルハンス島β細胞中でPDIファミリータンパク質の発現維持に働いており、その機能はインスリンの正しい折り畳みに必要であることを見出して報告した。
また、無細胞合成系を用いて作製したリボソーム―新生鎖複合体に対するPDIファミリー酵素を介したジスルフィド結合導入機構の解析についても、研究が大きく進んだ。具体的には、PDIとERp46共に新生鎖に天然型のジスルフィド結合を導入することができるが、PDIは効率的なジスルフィド結合導入のために、より長い新生鎖を要することを見出した。実際、高速原子間力顕微鏡によりPDIまたはERp46と新生鎖との結合様式を一分子レベルで観察したところ、PDIは新生鎖を取り囲むかたちで二量体を形成するのに対し、ERp46は単なる拡散過程で新生鎖と一過的に結合することが明らかとなった。すなわち、PDIとERp46では新生鎖に対する認識機構が大きく異なり、PDIは二量体を形成することで、よりタイトに新生鎖に結合し、天然型のジスルフィド結合を導入することが示された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

タンパク質のジスルフィド結合形成は、新生鎖の合成、局在化、立体構造形成等とカップルし進行すると予想されるが、その実態は不明である。この反応を理解するために、申請者らは小胞体内に輸送された新生鎖にジスルフィド結合が形成される様子を観察するための系を開発した。本年度は、更に、立体構造形成特異的な抗体を利用することで、新生鎖に正しい組み合わせのジスルフィド結合が形成されるタイミングを調べることに初めて成功した。その結果、新生鎖の翻訳合成の特定のタイミングでジスルフィド結合が、非天然型のものから天然型のものへと組み換えられること等が判明した。これは、小胞体内におけるタンパク質の折り畳み機構を考える上で重要な発見である。翻訳合成の特定のタイミングでジスルフィド結合の組み換え反応が誘起される現象は予想外で極めて興味深いが、その理由は不明であり、平成30年度はその仕組みを解明する。

今後の研究の推進方策

以下の実験によって、リボソーム上における新生鎖の合成とジスルフィド結合形成反応がどのように共役しているのかを解明する。
①LDLRの新生鎖が特定の大きさにまで伸長するとR1ドメインのジスルフィド結合が非天然型のものから天然型のものへと組み換えられる。その分子機構を理解するために、本年度は、N末端から長さの異なるLDLRの新生ポリペプチド鎖を作成し利用することによって、新生鎖がどこまで伸長した時に、この反応が誘起されるのかを明らかにする。
②還元条件下泳動したLDLRの新生鎖のバンドの濃さの変化から、LDLRの翻訳伸長速度は80kDa付近で著しく低下すると予想される。平成30年度は、リボソームプロファイリング法でその位置を正確に調べ、その情報をもとに翻訳速度が低下しない変異体を作成し解析することにより、翻訳伸長速度の制御がLDLRの折りたたみ経路上どのような意義を持つのかを解明する。
③リボソームー新生鎖複合体に対するPDIファミリー酵素の作用機序を解明するため、高速AFMによる一分子観察を統計的解析が可能となるまで繰り返し行う。さらに、長さの異なる新生鎖のバリエーションを増やし、PDIとERp46による新生差認識機構とジスルフィド結合を導入効率の関係について、考察を深める。

研究成果

• [国際共同研究] San Raffaele Scientific Institute(イタリア)
  • 国名: イタリア
  • 外国機関名: San Raffaele Scientific Institute
• [雑誌論文] IRE1-XBP1 pathway regulates oxidative proinsulin folding in pancreatic β cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuchiya, Y., Saito, M., Kadokura, H., Miyazaki, J.-i., Tashiro, F., Imagawa, Y., Iwawaki, T., and Kohno, K.
  • 雑誌名: The Journal of Cell Biology 巻: 217 ページ: 1287～1301
  • DOI: 10.1083/jcb.201707143
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The highly dynamic nature of ERdj5 is key to efficient elimination of aberrant protein oligomers through ER-associated degradation (2017)
  • 著者名/発表者名: Maegawa, K., Watanabe, S., Noi, K., Okumura, M., Amagai, Y., Inoue, M., Ushioda, R., Nagata, K., Ogura, T. and Inaba, K.
  • 雑誌名: Structure 巻: 25 ページ: 846-857
  • DOI: 10.1016/j.str.2017.04.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis of pH-dependent client binding by ERp44, a key regulator of protein secretion at the ER-Golgi interface (2017)
  • 著者名/発表者名: Watanabe, S., Harayama, M., Kanemura, S., Sitia, R. and Inaba, K.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA 巻: 114 ページ: 3224-3232
  • DOI: 10.1073/pnas.1621426114
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Preparation of selenoinsulin as a long-lasting insulin analog (2017)
  • 著者名/発表者名: Arai, K., Takei, T., Okumura, M., Watanabe, S. Amagai, Y., Asahina, Y., Moroder, L., Hojo, H., Inaba, K. and Iwaoka, M.
  • 雑誌名: Angewandte Chemie Int. Ed. 巻: 56 ページ: 5522-5526
  • DOI: 10.1002/anie.201701654
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Cysteinyl-tRNA synthetase governs cysteine polysulfidation and mitochondrial bioenergetics (2017)
  • 著者名/発表者名: Akaike, T., Inaba K. et al.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 8 ページ: 1177
  • DOI: 10.1038/s41467-017-01311-y
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] X線小角散乱解析が明らかにしたPDIファミリータンパク質ERp46及びPDI酸化酵素Ero1αの構造ダイナミクスと機能 (2017)
  • 著者名/発表者名: 金村 進吾、奥村 正樹、稲葉 謙次
  • 雑誌名: 分子研レターズ 巻: 76 ページ: 34-36
  • 査読あり
• [学会発表] Observing co-translational oxidative folding of a cell surface protein in the ER of mammalian cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Yo Fukuda, Yui Dazai, Naoya Hirai, Orie Nakamura, Kenji Inaba, Hiroshi Kadokura
  • 学会等名: CLS, Tokyo Tech. International Forum 2018 “Redox regulation of protein functions, transcription, translation and folding、東京工業大学キャンパス・イノベーションセンター
  • 国際学会
• [学会発表] The highly dynamic nature of ERdj5 plays a key role in efficient ER-associated degradation of aberrant protein oligomers (2018)
  • 著者名/発表者名: Inaba, K.
  • 学会等名: CLS Tokyo Inst Tech, International Forum
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] LDL受容体の新生ポリペプチド鎖におけるジスルフィド結合形成機構の解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 福田 洋，太宰 結，中村織江，稲葉謙次，門倉 広
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] Cotranslational oxidative folding of a cell surface membrane protein in mammalian cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Yui Dazai, Orie Nakamura, Yo Fukuda, Kenji Inaba, Hiroshi Kadokura
  • 学会等名: International Symposium on Protein Quality Control
  • 国際学会
• [学会発表] Observing cotranslational oxidative folding of a cell surface membrane protein (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Kadokura
  • 学会等名: Microbial Genetics and Genomics VI
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structural basis of redox-dependent regulation of Sarco/Endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2b (SERCA2b) (2017)
  • 著者名/発表者名: Inaba, K.
  • 学会等名: The 55th Annual Meeting of Japan Biophysical Society
  • 招待講演
• [学会発表] How do PDI family members act on nascent chains to catalyze their oxidative folding? (2017)
  • 著者名/発表者名: Okumura, M., Hirayama, C., Noi, K., Machida, K., Imataka, H., Ogura, T. and Inaba, K.
  • 学会等名: The 17th Annual Meeting of Japan Protein Science Society
  • 招待講演
• [備考] 東北大学多元物質科学研究所 稲葉研究室
  • URL: http://www.tagen.tohoku.ac.jp/labo/inaba/
• [備考] 東北大学大学院生命科学研究科 | 稲葉謙次
  • URL: https://www.lifesci.tohoku.ac.jp/research/teacher/detail.html?id=16689
• [備考] 東北大学大学院生命科学研究科 | 門倉 広
  • URL: https://www.lifesci.tohoku.ac.jp/research/teacher/detail.html?id=19734