ヒトiPS細胞と霊長類モデルを用いた治療開発の基盤整備

2014 年度 実績報告書

• 研究領域: 脳タンパク質老化と認知症制御
• 研究課題/領域番号: 26117007
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 岡野 栄之 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (60160694)
• 研究期間 (年度): 2014-07-10 – 2019-03-31
• キーワード: iPS細胞 / マーモセット / 認知症

研究実績の概要

本研究では患者iPS細胞由来神経細胞を用いた in vitro モデル系の構築、及びトランスジェニック霊長類作出技術を用いた in vivo 疾患モデル系を構築する。更に、これらの独立したモデル系を相互に連携させることで、脳タンパク質老化の分子機構から認知症発症に至る全体像を明らかにし、治療開発に繋げる。
まず、ヒト体細胞からのiPS細胞誘導法の改良を進めた。健常人由来抹消血単核球(PBMC)、及び単離したT細胞に、それぞれエピソーマルベクター法により再プログラム化因子を加え、フィーダー細胞上に播種した。フィーダー細胞にはマウス胎児線維芽細胞（MEF）あるいはSTO細胞を用いた。その結果、単離T細胞を用いてMEF上で樹立した際にiPS細胞誘導効率が最も高かった。
患者iPS細胞については、新潟大学脳研究所・池内健博士らと共同で患者体細胞の採取を進めている。既に、慶應義塾大学及び新潟大学の倫理審査委員会において本研究の倫理申請を行い、承認を得た。そこで、R406W変異を有するFTDP-17患者及びその家族の同意の元、採血を行った。患者２名の血液を用い、iPS細胞樹立を開始した。先行する１ラインについては、既に複数のiPSクローンを得た。
トランスジェニックマーモセットについては、P301L変異型タウ遺伝子をドキシサイクリン（Dox）誘導性に発現するレンチウイルスベクターと、Dox依存的転写活性因子(tTA)を神経細胞特異的に発現するレンチウイルスベクターの二種類のウイルスベクターをマーモセット初期胚に感染させることで、作出を進めている。ウイルスベクターを顕微注入した胚の一部において、ウイルスベクターが導入されたことを示す蛍光レポーター遺伝子の発現が認められたものの、いずれも発生を停止したため子宮移植には至っていない。引き続きウイルスベクターの顕微注入を行っている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

倫理申請の承認及びR406W変異を有するFTDP-17患者２名からの採血を完了し、末梢血単核球及びT細胞の増幅を行った。これらのT細胞にリプログラミング因子を発現するエピソーマルベクターの導入を行い、iPS細胞の樹立を試みるに至った。先行して得られた患者１名の血液に関しては、既に複数のiPSクローンを得ることに成功した。これらの細胞の増幅及びPCRによりベクターが除去されていることの確認を現在行っており、研究は概ね順調に推移していると言える。
トランスジェニックマーモセットの作出については、P301L変異型タウ遺伝子をDOX誘導性に発現するコンストラクトと、tTAを神経系において発現するコンストラクトを作製し、それぞれレンチウイルスベクターを調製した。これらのレンチウイルスベクターを、マーモセット初期胚へ感染させる実験を開始するに至っている。現在、感染の指標とする蛍光レポーター遺伝子の発現がみられないか、あるいは蛍光レポーター遺伝子の発現がみられても途中で胚発生が停止しており、子宮移植には至らなかった。引き続きマーモセット初期胚へのウイルスベクターの感染実験を進めている。

今後の研究の推進方策

タウ遺伝子R406W変異を有する疾患iPS細胞については、先行して樹立した１ラインについて、エピソマールベクターの除去を確認し、iPS細胞としての性質を確認する。具体的には、多能性マーカーの発現、多分化能の確認、および核型解析を行う。残りの１ラインについては、引き続きiPS細胞の樹立を試みる。iPSクローンが得られ次第、同様の解析を行う。また、表現型解析のコントロールとして、ゲノム編集技術CRIPR/Cas9 系を用い、変異を正常型（R406）に修復したiPS細胞の作出を行う。並行して、神経分化誘導法について条件の最適化を試みる。材料が揃い次第、iPS細胞由来神経細胞における表現型解析を開始する。
トランスジェニックマーモセットの作出については、引き続きウイルスベクターの顕微注入を行い、良好な胚が得られ次第、仮親の子宮に移植を行う。また、現在用いているウイルスベクターによって良好なトランスジェニック胚が得られない場合に備え、発現調節の様式を変更し、薬剤によらず変異タウ遺伝子を恒常的に発現する改良型のレンチウイルスベクターの構築も並行して行う。

研究成果

• [国際共同研究] University of Rochester/Broad Institute of Harvard and MIT/Johns Hopkins University(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of Rochester/Broad Institute of Harvard and MIT/Johns Hopkins University
• [雑誌論文] Clinical utility of neuronal cells directly converted from fibroblasts of patients for neuropsychiatric disorders: studies of lysosomal storage diseases and channelopathy. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kano SI, Yuan M, Cardarelli RA, Maegawa G, Horiuchi Y, Higurashi N, Gaval-Cruz M, Wilson AM, Tristan C, Kondo MA, Chen Y, Koga M, Obie C, Ishizuka K, Seshadri S, Srivastava R, Kato TA, Sedlak TW, Lee Y, Rapoport JL, Hirose S, Okano H, Valle D, O’Donnell P, Sawa A, Kai M.
  • 雑誌名: Curr Mol Med. 巻: 15 ページ: 138-45.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Controlling Immune Rejection Is a Fail-Safe System against Potential Tumorigenicity after Human iPSC-Derived Neural Stem Cell Transplantation. (2015)
  • 著者名/発表者名: Itakura G, Kobayashi Y, Nishimura S, Iwai H, Takano M, Iwanami A, Toyama Y, Okano H, Nakamura M.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 10 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0116413. eCollection 2015.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Long-Term Safety Issues of iPSC-Based Cell Therapy in a Spinal Cord Injury Model: Oncogenic Transformation with Epithelial-Mesenchymal Transition. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nori S, Okada Y, Nishimura S, Sasaki T, Itakura G, Kobayashi Y, Renault-Mihara F, Shimizu A, Koya I, Yoshida R, Kudoh J, Koike M, Uchiyama Y, Ikeda E, Toyama Y, Nakamura M, Okano H.
  • 雑誌名: Stem Cell Reports. 巻: 4 ページ: 360-73
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2015.01.006.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Ultra-high-resolution MR imaging of esophageal carcinoma at ultra-high field strength (7.0 T) ex vivo: Correlation with histopathologic findings. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yamada I, Miyasaka N, Hikishima K, Tokairin Y, Kawano T, Ito E, Kobayashi D, Eishi Y, Okano H.
  • 雑誌名: Magn Reson Imaging. 巻: 33 ページ: 413-9
  • DOI: 10.1016/j.mri.2014.11.005.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Parkinson Disease: Diffusion MR Imaging to Detect Nigrostriatal Pathway Loss in a Marmoset Model Treated with 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hikishima K, Ando K, Yano R, Kawai K, Komaki Y, Inoue T, Itoh T, Yamada M, Momoshima S, Okano HJ, Okano H.
  • 雑誌名: Radiology. 巻: 275 ページ: 430-7
  • DOI: 10.1148/radiol.14140601.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Alternative Role of HuD Splicing Variants in Neuronal Differentiation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hayashi S, Yano M, Igarashi M, Okano HJ, Okano H.
  • 雑誌名: J Neurosci Res. 巻: 93 ページ: 311-23
  • DOI: 10.1002/jnr.23496.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cadherin-7 Regulates Mossy Fiber Connectivity in the Cerebellum. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kuwako K, Nishimoto Y, Kawase S, Okano HJ, Okano H.
  • 雑誌名: Cell Rep. 巻: 9 ページ: 311-23
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2014.08.063.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Focal Transplantation of Human iPSC-Derived Glial-Rich Neural Progenitors Improves Lifespan of ALS Mice. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kondo T, Funayama M, Tsukita K, Hotta A, Yasuda A, Nori S, Kaneko S, Nakamura M, Takahashi R, Okano H,
  • 雑誌名: Stem Cell Reports. 巻: 3 ページ: 242-9.
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2014.05.017.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Leptin Receptor Makes Its Mark on MSCs. (2014)
  • 著者名/発表者名: Matsuzaki Y, Mabuchi Y, Okano H.
  • 雑誌名: Cell Stem Cell. 巻: 15 ページ: 112-4
  • DOI: 10.1016/j.stem.2014.07.001.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Yb Integrates piRNA Intermediates and Processing Factors into Perinuclear Bodies to Enhance piRISC Assembly. (2014)
  • 著者名/発表者名: Murota Y, Ishizu H, Nakagawa S, Iwasaki YW, Shibata S, Kamatani MK, Saito K, Okano H, Siomi H, Siomi MC.
  • 雑誌名: Cell Rep. 巻: 8 ページ: 103-13.
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2014.05.043.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Involvement of ER Stress in Dysmyelination of Pelizaeus-Merzbacher Disease with PLP1 Missense Mutations Shown by iPSC-Derived Oligodendrocytes. (2014)
  • 著者名/発表者名: Numasawa-Kuroiwa Y, Okada Y, Shibata S, Kishi N, Akamatsu W, Shoji M, Nakanishi A, Oyama M, Osaka H, Inoue K, Takahashi K, Yamanaka S, Kosaki K, Takahashi T, Okano H.
  • 雑誌名: Stem Cell Reports. 巻: 2 ページ: 648-61
  • DOI: 10.1016 /j.stemcr.2014.03.007. eCollection 2014.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The use of induced pluripotent stem cells to reveal pathogenic gene mutations and explore treatments for retinitis pigmentosa. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T, Ozawa Y, Suzuki K, Yuki K, Ohyama M, Akamatsu W, Matsuzaki Y, Shimmura S, Mitani K, Tsubota K, Okano H.
  • 雑誌名: Mol Brain. 巻: 7 ページ: -
  • DOI: 10.1186/1756-6606-7-45.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Small RNA profiling and characterization of piRNA clusters in the adult testes of the common marmoset, a model primate. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirano T, Iwasaki YW, Lin ZY, Imamura M, Seki NM, Sasaki E, Saito K, Okano H, Siomi MC, Siomi H.
  • 雑誌名: RNA. 巻: 20 ページ: 1223-37
  • DOI: 10.1261/rna.045310.114.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Utility of Scalp Hair Follicles as a Novel Source of Biomarker Genes for Psychiatric Illnesses. (2014)
  • 著者名/発表者名: Maekawa M, Yamada K, Toyoshima M, Ohnishi T, Iwayama Y, Shimamoto C, Toyota T, Nozaki Y, Balan S, Matsuzaki H, Iwata Y, Suzuki K, Miyashita M, Kikuchi M, Kato M, Okada Y, Akamatsu W, Mori N, Owada Y, Itokawa M, Okano H, Yoshikawa T.
  • 雑誌名: Biol Psychiatry. 巻: 78 ページ: 116-25.
  • DOI: 10.1016/j.biopsych.2014.07.025.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Brain-mapping projects using the common marmoset. (2014)
  • 著者名/発表者名: Okano H, Mitra P.
  • 雑誌名: Neurosci Res. 巻: 93 ページ: 3-7
  • DOI: 10.1016/j.neures.2014.08.014.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] iPS細胞技術を用いた医療革命 (2015)
  • 著者名/発表者名: 岡野栄之
  • 学会等名: 第14回日本再生医療学会総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2015-03-20 – 2015-03-20
  • 招待講演
• [学会発表] iPS細胞を用いた脊髄損傷の再生医療について～京浜臨海部ライフイノベーション国際戦略総合特区の取組みから～ (2015)
  • 著者名/発表者名: 岡野栄之
  • 学会等名: 第14回日本再生医療学会総会ランチョンセミナー
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2015-03-19 – 2015-03-19
  • 招待講演
• [学会発表] ヒト iPS細胞における多能性状態の改変 (2015)
  • 著者名/発表者名: 木佐文彦、塩澤誠司, 岡野栄之
  • 学会等名: 第14回に本再生医療学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2015-03-19 – 2015-03-19
• [学会発表] コモンマーモセット ES 細胞における多能性状態の改変 (2015)
  • 著者名/発表者名: 塩澤誠司, 岡原純子, 佐々木えりか, 岡野栄之
  • 学会等名: 第14回に本再生医療学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2015-03-19 – 2015-03-19
• [学会発表] iPS細胞と遺伝子改変霊長類を用いた神経疾患の病態解明と創薬研究 (2015)
  • 著者名/発表者名: 岡野栄之
  • 学会等名: 第88回 日本薬理年会学会年会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • 年月日: 2015-03-18 – 2015-03-18
  • 招待講演
• [学会発表] Brain Science using Transgenic non-Human Primates (2015)
  • 著者名/発表者名: Hideyuki Okano
  • 学会等名: 第５回新潟大学脳研究所共同研究拠点国際シンポジウム
  • 発表場所: Center for Integrated Human Brain Science (6F), Niigata University（新潟県新潟市）
  • 年月日: 2015-03-06 – 2015-03-06
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Brain Mapping Project using the common marmoset. (2015)
  • 著者名/発表者名: 岡野栄之
  • 学会等名: 第4回日本マーモセット研究会
  • 発表場所: 犬山国際観光センター フロイデ（愛知県犬山市）
  • 年月日: 2015-01-23 – 2015-01-23
  • 招待講演
• [学会発表] Conversion of the pluripotent state in common marmoset ES cells (2015)
  • 著者名/発表者名: 塩澤誠司, 岡原純子, 佐々木えりか, 岡野栄之
  • 学会等名: 第4回日本マーモセット研究会
  • 発表場所: 犬山国際観光センター フロイデ（愛知県犬山市）
  • 年月日: 2015-01-23 – 2015-01-23
• [学会発表] マーモセットES細胞におけるゲノム編集技術の確立 (2015)
  • 著者名/発表者名: 吉松祥,塩澤誠司,岸憲幸,岡野栄之
  • 学会等名: 第4回日本マーモセット研究会
  • 発表場所: 犬山国際観光センター フロイデ（愛知県犬山市）
  • 年月日: 2015-01-23 – 2015-01-23
• [学会発表] Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on human iPS cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hideyuki Okano
  • 学会等名: The 18th Takeda Science Foundation Symposium on Bioscience”iPS Cells for Regenerative Medicine”
  • 発表場所: Center for Learning and Innovation (CLI), Takeda Pharmaceutical Company, Ltd., （大阪府吹田市）
  • 年月日: 2015-01-15 – 2015-01-15
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Modeling psychiatric/neurological disorders using iPS cell technologies and transgenic non-human primates. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hideyuki Okano
  • 学会等名: BROAD Institute Seminar
  • 発表場所: Auditorium, BROAD Institute, Cambridge (USA)
  • 年月日: 2014-12-04 – 2014-12-04
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Transgenic marmosets for modeling human nuerological and psychiatric disorders (2014)
  • 著者名/発表者名: Hideyuki Okano
  • 学会等名: "Transgenic Primate Models of Human Brain" at Neuroscience 2014
  • 発表場所: the Walter E. Washington Convention Center, Washington DC (USA)
  • 年月日: 2014-11-19 – 2014-11-19
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] iPS Cell Technologies:Significance and Applications to CNS Regeneration and Disease Research. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hideyuki Okano
  • 学会等名: 2014 WASF on Stem Cell Research and Regenerative Medicine “The Impact of Regenerative Medicine 2014”
  • 発表場所: Mission Bay Converence Center at UCSF, San Francisco (USA)
  • 年月日: 2014-11-06 – 2014-11-06
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Brain science using iPS Cell technology and transgenic non-human primates. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hideyuki Okano
  • 学会等名: 29th CINP World Congress of Neuropsychopharmacology
  • 発表場所: Vancouver Convention Centre, Vancouver (Canada)
  • 年月日: 2014-10-24 – 2014-10-24
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Modeling neurological and psychiatric disorders using iPSC technologies and transgenic non-human primates. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hideyuki Okano
  • 学会等名: BRIDGING BIOMEDICAL WORLDS (BBW 2014)
  • 発表場所: China National Convention Center (CNCC), Beijing (China)
  • 年月日: 2014-10-14 – 2014-10-14
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/ MINDS). (2014)
  • 著者名/発表者名: Hideyuki Okano
  • 学会等名: Human Brain Project (HBP) Summit 2014
  • 発表場所: Kirchhoff Institute for Physics（KIP), Heidelberg (Germany)
  • 年月日: 2014-09-29 – 2014-09-29
  • 国際学会 / 招待講演
• [図書] 再生医療 幹細胞と疾患iPS細胞の研究最前線2015 (2015)
  • 著者名/発表者名: 岡野栄之 山中伸弥（編集）
  • 総ページ数: 238
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 再生医療 用語ハンドブック (2015)
  • 著者名/発表者名: 岡野栄之 下門大祐 岡田洋平 澤本和延 山下徹 中村雅也 他
  • 総ページ数: 11111
  • 出版者: 株式会社メディカルトリビューン
• [備考] 慶應義塾大学医学部生理学教室岡野研
  • URL: http://www.okano-lab.com/
• [産業財産権] ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法 (2015)
  • 発明者名: 岡野栄之 塩澤誠司 木佐文彦
  • 権利者名: 岡野栄之 塩澤誠司 木佐文彦
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願 2015-054907
  • 出願年月日: 2015-03-18
• [産業財産権] 内耳性難聴治療薬 (2015)
  • 発明者名: 細谷誠 藤岡正人 岡野栄之 小川 郁 松永達雄
  • 権利者名: 細谷誠 藤岡正人 岡野栄之 小川 郁 松永達雄
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願 2015-007849
  • 出願年月日: 2015-01-15