計画研究
本年度は、R406Wタウ遺伝子変異をもつFTDP-17家系の患者2名より、それぞれの患者につき3クローンの疾患iPS細胞の樹立に引き続き、CRISPR/Cas9のゲノム編集技術を用いて、それぞれの患者由来iPS細胞から、タウ遺伝子変異を野生型に修復したクローン、及びタウ遺伝子変異をホモに持つクローンを作製した。また神経細胞への分化誘導効率を上昇させるため、各々の樹立クローンから、Neurogenin2を誘導できるようなiPS細胞クローンを作製した。次に、これらのiPS細胞から、WNTシグナル阻害等の低分子化合物、或いはNeurogenin2遺伝子誘導による大脳皮質神経細胞への分化誘導系を確立した。このように分化誘導した、患者由来神経細胞を用いて、タウ変異の分子生物・生化学的解析、及び細胞生物学的な病態表現型を検討していく。タウオパチーin vivoモデルとして、独自の遺伝子改変技術を駆使し、変異型タウ遺伝子を発現するトランスジェニックマーモセットの作出を行っている。まず、FTDP-17家系で同定されたP301S変異を持つタウ遺伝子を発現するレンチウイルスを作製した。マーモセット初期胚へ感染し、変異型タウと2A配列で繋げたKusabira Orange（KO）の蛍光発現を指標として、遺伝子導入の確認できた初期胚が9個得られた。これらの胚を、仮親に移植したが、産仔を得るには至っていないため、引き続きレンチウイルスのインジェクション及び子宮移植を続けている。
2: おおむね順調に進展している
FTDP-17家系の患者2名の体細胞から3クローンずつのiPS細胞の樹立を完了していたが、本年度はCRISPR/Cas9のゲノム編集技術を用いて、患者iPS細胞が持つ変異アリルを野生型へ修復し2アリルの野生型タウを持つisogenic iPS細胞、及び患者iPS細胞が持つ野生型アリルを変異型へ改変し2アリルの変異型タウを持つisogenic iPS細胞の作製を完了した。さらに、前脳領域の神経細胞への分化誘導効率を上げるために、Neurogenin2遺伝子を誘導可能な発現プラスミドを、PiggyBacトランスポゾンを用いてそれぞれのiPS細胞へ導入し、Doxycyclineで高効率の神経分化を示すクローンを取得できた。次に、上記で作製した患者由来iPS細胞から、大脳皮質神経細胞で構成される二次元培養神経、及び脳オルガノイドを分化誘導する手法を確立した。これら、分化誘導したヒト大脳皮質神経細胞を用いて、変異タウの病態表現型を解析するインフラを整えた。変異タウの病態表現型として、先ずはタウ蛋白質の異常リン酸化について、首都大学東京・久永らと共同で、Phos-tag法により検討を行ったところ、FTDP-17患者iPS細胞由来の大脳神経細胞において、リン酸化状態が亢進している可能性が示されている。次に、R406W変異によるタウの局在変化について、免疫細胞化学染色にて検討を行ったところ、野生型のタウ蛋白質と比較して、変異タウはMAP2で染色されうる樹状突起及び細胞体への局在が上昇している傾向が認められた。
本研究では、タウオパチーに対する画期的な治療法開発を見据え、FTDP-17家系患者iPS細胞由来神経細胞を用いた in vitro モデル系、及びトランスジェニック霊長類作出技術を用いた in vivo モデル系を構築し、タウオパチー病態の分子機序の解明、及び薬剤の評価を行う。1) 疾患ヒトiPS 細胞の神経細胞への分化誘導及び解析上述の通り、平成28年度迄に、タウオパチーin vitroモデルとして、R406Wタウ遺伝子変異をもつFTDP-17患者由来のiPS細胞、またゲノム編集を使ったisogenic iPS細胞の作製を完了している。これらのiPS細胞を、平成28年度迄に確立した神経分化誘導法により神経細胞へと分化させ、分子生物・生化学的解析、及び細胞生物学的な病態表現型を検討する。リン酸化状態の検討、細胞内局在の解析、神経突起長の測定等を行い、コントロールと比較することでR406W変異による病態表現型を解析する。更に、各種のストレスに対する応答性の変化について、実験系の確立を行い、タウR406W変異iPS細胞由来神経細胞における神経脆弱性についての検討を行う。2) 変異型タウ・トランスジェニックマーモセットの作出及び解析平成28年度に一部改良を施したレンチウイルスベクターを用い、マーモセット受精卵への感染及び仮親への子宮移植を行っている。既に移植した胚について、産仔が得られ次第、遺伝型の解析を行う。また、引き続きファウンダー個体作出へ向け、受精卵への感染及び移植を行う。
すべて 2017 2016 その他
すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 1件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 2件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (26件) (うち国際学会 7件、 招待講演 26件) 備考 (1件) 産業財産権 (2件)
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