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2017 年度 実績報告書

ヒトiPS細胞と霊長類モデルを用いた治療開発の基盤整備

計画研究

研究領域脳タンパク質老化と認知症制御
研究課題/領域番号 26117007
研究機関慶應義塾大学

研究代表者

岡野 栄之  慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (60160694)

研究期間 (年度) 2014-07-10 – 2019-03-31
キーワードiPS細胞 / ゲノム編集 / マーモセット
研究実績の概要

本年度は、前年度に引き続き、R406W変異型タウ遺伝子を有するFTDP-17 iPS細胞由来神経細胞における表現型の解析を実施した。健常人由来iPS細胞株とR406Wヘテロ型変異iPS細胞株に加え、ゲノム編集技術(CRISPR/Cas9)を用いて、変異が修復された対照株と変異を両アレルに持つホモ型変異株を作出し、各々を大脳皮質興奮性神経細胞に分化させた後に、表現型の比較検討を行った。
表現型解析について、まず変異型タウタンパク質における異常の検出を行った。中でも、タウ病変との関連が示唆されている、タウタンパク質における異常リン酸化について検討を行った結果、特定のアミノ酸のリン酸化レベルの異常が認められた。更に、疾患患者由来神経細胞では断片化したタウが増加していることが明らかになった。この断片化に関わるプロテアーゼについても検討を行い、同定した。
次に、変異型タウによる神経変性の徴候の有無を検討した。βIII-tubulinやタウ抗体の染色を行った結果、変異型株由来神経細胞においては軸索の微小管の異常が認められ、正常株由来神経細胞と比べ、粒状構造体 (puncta)が有意に増えていたことが分かった。これらの現象は、前年度検出したタウの樹状突起への局在異常と相関して起こっていることも明らかとなった。
変異型タウ遺伝子トランスジェニックマーモセットの作出については、P301S変異タウ発現レンチウイルスベクターをマーモセット初期胚へ感染させたものの、発生毒性が示唆された。そこで、内在性タウに対し、ゲノム編集によるP301S変異の導入を試みる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

R406W変異型タウ遺伝子を有するFTDP-17 iPS細胞由来神経細胞における表現型の解析を実施し、リン酸化タウ抗体を用いてウェスタンブロットを試みたところ、R406W変異型株由来神経細胞においては、特定のアミノ酸におけるリン酸化レベルが低下しているなどリン酸化の異常が確認された他、35~40kDaのタウ断片が変異型株由来神経細胞において増加していることが示された。さらに、様々なプロテアーゼ阻害剤を加えて検証した結果、一部のタウ断片はカルパインによる分解物であることを特定するに至った。また、ハイコンテンツ・イメージアナライザーを用いた解析からR406W変異型株由来神経細胞におけるタウタンパクの局在異常、及び軸索におけるpunctaの形成などの表現型を定量的に検出することに成功している。
変異型タウ遺伝子トランスジェニックマーモセットの作出については、前年度に引き続きP301S変異タウ発現レンチウイルスベクターを用いたマーモセットトランスジェニック胚の作成を進めたものの、産仔を得るには至らなかった。過剰発現による発生毒性が示唆されたため、CRISPR-Cas9システムによるゲノム編集技術を用いた内在性タウへ変異の導入を試みており、ガイドRNA及びドナーDNAの設計を行った。

今後の研究の推進方策

本年度検出したR406W変異型タウ遺伝子を有するFTDP-17患者由来 iPS細胞由来神経細胞におけるタウのリン酸化や断片化などの異常が神経変性を引き起こすメカニズムについて追究していく。また、長期培養したiPS細胞由来神経細胞における表現型の解析を進めるとともに、iPS細胞から作出した脳オルガノイドの3Dイメージング方法を確立し、神経突起長及び構造などの解析を行う。更に、各種のストレスに対する応答性の変化を調べ、タウR406W変異iPS細胞由来神経細胞における脆弱性について検討を行う。
並行して、Washington Universityから入手したタウR406W変異及びタウP301L変異を有するFTDP患者由来線維芽細胞から新たにiPS細胞を樹立する。
変異タウマーモセットの作出については、設計したガイドRNA及びドナーDNAの性能評価を、マーモセットES細胞を用いて行う。

  • 研究成果

    (16件)

すべて 2018 2017 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 8件、 招待講演 8件) 備考 (1件) 産業財産権 (1件) (うち外国 1件)

  • [国際共同研究] Washintong University(米国)

    • 国名
      米国
    • 外国機関名
      Washintong University
  • [雑誌論文] Nitrative Stress and Tau Accumulation in Amyotrophic Lateral Sclerosis/Parkinsonism-Dementia Complex (ALS/PDC) in the Kii Peninsula, Japan2018

    • 著者名/発表者名
      Hata Yukiko、Ma Ning、Yoneda Misao、Morimoto Satoru、Okano Hideyuki、Murayama Shigeo、Kawanishi Shosuke、Kuzuhara Shigeki、Kokubo Yasumasa
    • 雑誌名

      Frontiers in Neuroscience

      巻: 11 ページ: 未定

    • DOI

      10.3389/fnins.2017.00751

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Investigation of brain science and neurological/psychiatric disorders using genetically modified non-human primates2018

    • 著者名/発表者名
      Okano Hideyuki、Kishi Noriyuki
    • 雑誌名

      Current Opinion in Neurobiology

      巻: 50 ページ: 1~6

    • DOI

      10.1016/j.conb.2017.10.016

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Rostrocaudal Areal Patterning of Human PSC-Derived Cortical Neurons by FGF8 Signaling2018

    • 著者名/発表者名
      Kent Imaizumi, Koki Fujimori, Seiji Ishii, Asako Otomo, Yasushi Hosoi, Hiroaki Miyajima, Hitoshi Warita, Masashi Aoki, Shinji Hadano, Wado Akamatsu and Hideyuki Okano
    • 雑誌名

      eNeuro

      巻: 未定 ページ: 未定

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Naive-like ESRRB + iPSCs with the Capacity for Rapid Neural Differentiation2017

    • 著者名/発表者名
      Kisa Fumihiko、Shiozawa Seiji、Oda Keisuke、Yoshimatsu Sho、Nakamura Mari、Koya Ikuko、Kawai Kenji、Suzuki Sadafumi、Okano Hideyuki
    • 雑誌名

      Stem Cell Reports

      巻: 9 ページ: 1825~1838

    • DOI

      10.1016/j.stemcr.2017.10.008

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Escape from Pluripotency via Inhibition of TGF-β/BMP and Activation of Wnt Signaling Accelerates Differentiation and Aging in hPSC Progeny Cells2017

    • 著者名/発表者名
      Fujimori Koki、Matsumoto Takuya、Kisa Fumihiko、Hattori Nobutaka、Okano Hideyuki、Akamatsu Wado
    • 雑誌名

      Stem Cell Reports

      巻: 9 ページ: 1675~1691

    • DOI

      10.1016/j.stemcr.2017.09.024

    • 査読あり
  • [学会発表] Modeling Human Diseases with iPS Cells and Genetically Modified Non-Human Primates: Cornea and Ocular Surface Biology and Pathology2018

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Okano
    • 学会等名
      Gordon Research Conference
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Brain Science and Disease Modeling with Genetically Modified Non-human Primates2018

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Okano
    • 学会等名
      4th INT International Conference
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Preemptive Medicine for Dementia and Neurodegenerative Diseases using iPSC-Technologies and Genetically Modified Non-human Primates2017

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Okano
    • 学会等名
      Keystone Symposia: Aging and Mechanisms of Aging-Related Disease
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] New Insights from the Brain Mapping Project in Japan: Modeling Human Diseases with Genetically Modified Common Marmosets2017

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Okano
    • 学会等名
      Cold Spring Harbor Asia Symposium on Primate Neuroscience
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Brain/MINDS: Brain Mapping Project in Japan using Marmosets2017

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Okano
    • 学会等名
      Brains at the Dome
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Disease Modeling and Brain Mapping using genetically modified marmosets2017

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Okano
    • 学会等名
      Keystone Symposia: State of the Brain
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Challenge toward iPSCs based therapy and modeling of CNS disorders2017

    • 著者名/発表者名
      Hideyuki Okano
    • 学会等名
      The 13th World Stem Cell Summit
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Characterization of common marmoset ES cells in the naive pluripotent state2017

    • 著者名/発表者名
      Seiji Shiozawa, Junko Okahara, Erika Sasaki, Hideyuki Okano
    • 学会等名
      International Society for Stem Cell Research 15th annual meeting
    • 国際学会 / 招待講演
  • [備考] 岡野研 Weblog

    • URL

      http://www.okano-lab.com

  • [産業財産権] 筋萎縮性側索硬化症治療剤及び治療用組成物2017

    • 発明者名
      岡野 栄之、藤森 康希、奥野 博庸
    • 権利者名
      岡野 栄之、藤森 康希、奥野 博庸
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      PCT/JP2017/030899
    • 外国

URL: 

公開日: 2018-12-17   更新日: 2022-02-28  

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