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2016 年度 実績報告書

ODMRとin-cell NMRによる細胞内蛋白質間相互作用・動態の解析法の開発

計画研究

研究領域動的構造生命科学を拓く新発想測定技術-タンパク質が動作する姿を活写する-
研究課題/領域番号 26119004
研究機関京都大学

研究代表者

白川 昌宏  京都大学, 工学研究科, 教授 (00202119)

研究期間 (年度) 2014-07-10 – 2019-03-31
キーワードODMR / in-cell NMR / 細胞内蛋白質 / 細胞小器官 / Rheo-NMR
研究実績の概要

細胞内蛋白質・小器官の立体構造・運動性・超分子複合体形成等と温度活性酸素濃度や微水流といった環境を生きた細胞の中で計測する手法の開発を目的とし、細胞内の特定の蛋白質の高次元NMR測定であるin-cell NMR法、蛋白質の構造と集合状態に対する影響を計測するRHEO(RHEOLOGY)-NMR、ダイアモンドナノ粒子(ND)を使った光検出磁気共鳴法(ODMR)の装置と測定手法を開発する。
ODMRに関しては、要素技術である①測定技術、②プローブ粒子の至適化とタンパク質の標識化、③細胞へのターゲッティング、④得られた情報の処理と解釈、について完成を目指す。①に関しては装置の改良、特に光学系検出器の感度向上と検出手法の至適化により時間単位の感度が向上した。まだin vitroの系でしかODMR信号を測定していなかった5 nm径NDについて、細胞における高時間分解能イメージングを目指したが、超多分岐修飾が凝集体系性に阻まれおり、今後の課題である。③については、細胞内小器官や細胞骨格、具体的にはアクチン線維へターゲッティングした。線維状のアクチン分子の線維軸廻りの回転運動は、伸縮長と良い相関を示すこと、回転運動性は同一線維や束状では同調すること等が判明し、NDを用いたODMRにより細胞内の蛋白質集合体の微細な動きをリアルタイム検出できることが証明された。
In-cell NMRに関しては、蛋白質の細胞内の並進拡散を計測しうるin-cell diffusion NMRの準備的な測定を行い、今後は再現性を含めてより精度と信頼度の高い測定法の確立を目指すと共に、FRAP等の蛍光を使った測定と比較対照しながら解析を進める。蛋白質の立体構造や機能に与える影響を流体力学的観点からも解析するためRheo-NMRを導入し、大変興味深い結果を得た。解釈を含め検討中である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究では細胞内蛋白質・小器官の立体構造・運動性・超分子複合体形成等を生きた細胞の中で計測する手法の確立を目的とし、細胞内の特定の蛋白質の高次元NMR測定であるin-cell NMR法とダイアモンドナノ粒子(ND)を使った光検出磁気共鳴法(ODMR)の開発を進めた。
ODMRに関する研究では、要素技術となる①測定技術、②プローブ粒子の至適化とタンパク質の標識化、③細胞へのターゲッティング、④得られた情報の処理と解釈、について開発研究を行った。①に関しては装置の改良、取り分け光学系検出器の感度向上と検出手法の至適化により時間単位の感度向上をすすめた。③については、アクチン線維にナノダイアモンド粒子をターゲティングする事に成功した。特にアクチン線維へのターゲティングは、ODMRの測定により、アクチン粒子が、繊維長の伸縮に伴い線維軸を軸とする回転をすること、その運動が同一線板場状では同期していることを示した。これは当初に掲げた大きな目標の一つで、本研究のランドマーク的成果である。また磁気共鳴系においてはマイクロ波のパルス照射が可能になるようにハードウエアの改良と、其れを利用した緩和時間測定の実験手法の導入とデータ処理技術の開発を進めた。ELDORなどの多重共鳴パルスESR測定によるスピン間距離の計測への準備は共同研究者のETHの瀬川博士によって進められた。と進む。さらに、測定手法の導入、改良に伴い、④のデータ処理技術も適時、改訂・開発を行う。
In-cell NMRに関しては、蛋白質の細胞内の並進拡散の準備的な計測を試みた。流体力学的効果が蛋白質の立体構造や機能に与える影響を解析するためRheo-NMRの装置を開発し、測定を行った。非常に興味深い結果を得た。

今後の研究の推進方策

細胞内蛋白質・小器官の立体構造・運動性・超分子複合体形成等を生細胞中で計測する手法の開発を目的とし、細胞内の特定の蛋白質の高次元NMR測定であるin-cell NMR法とダイアモンドナノ粒子(ND)を使った光検出磁気共鳴法(ODMR)の開発を更に進める。
その目的を達成するために、以下の方策で研究を進める。
ODMRを利用したナノジャイロメーターの開発研究に関しては、細胞膜、核、ミトコンドリアなどのオルガネラ、細胞骨格繊維等にターゲッティングし、様々な生命現象における蛋白質の動態を解析しうる手法の確立を目指してきた。昨年度までに、in vitroのF1-ATPaseの回転、細胞内アクチンファイバーの捻れ振動、膜タンパク質の振動については満足できる手法を確立しえた。今後はこれらを基にして、種々の細胞内タンパク質、オルガネラの運動の定量的解析モデルを構築する。
粒子近傍のラジカル量等の計測を目指した、ダイアモンド中のNVC(-)に局在する電子の緩和時間測定については、昨年度からの研究を継続し、感度と精度の高い手法の確立を目指す。そのセンサーを、膜イオンチャネルや、ミトコンドリア、葉緑体の膜にターゲットし、緩和時間の変動を計測するとともに、モデルを立て、ラジカル量等やその発生機構などを解明する。
in-cell NMRに関しては、細胞内の並進拡散係数の測定をすると共に、細胞内の蛋白質の緩和実験から、回転拡散の相関時間等のデータを得る。得られた情報の処理と解釈により、その流体力学的効果を明らかにする。蛋白質の挙動はRheo-NMRによっても検証する。

  • 研究成果

    (11件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 3件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (7件) (うち国際学会 1件、 招待講演 7件)

  • [雑誌論文] Practical considerations for investigation of protein conformational dynamics by 15N R 1ρ relaxation dispersion.2017

    • 著者名/発表者名
      Walinda E, Morimoto D, Shirakawa M, Sugase K.
    • 雑誌名

      Biomol NMR.

      巻: 印刷中 ページ: 印刷中

    • DOI

      10.1007/s10858-017-0097-6

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Backbone resonance assignments of monomeric SOD1 in dilute and crowded environments.2017

    • 著者名/発表者名
      Iwakawa N, Morimoto D, Walinda E, Sugase K,Shirakawa M
    • 雑誌名

      Biomol NMR Assign.

      巻: 11 ページ: 81~84

    • DOI

      10.1007/s12104-016-9724-5

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Ubiquitylation Directly Induces Fold Destabilization of Proteins.2016

    • 著者名/発表者名
      Morimoto D , Walinda E, Fukada H, Sugase K, Shirakawa M
    • 雑誌名

      Sci Rep.

      巻: 6 ページ: 39453

    • DOI

      10.1038/srep39453. DOI: 10.1038/srep39453

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] A Nanodiamond-peptide Bioconjugate for Fluorescence and ODMR Microscopy of a Single Actin Filament.2016

    • 著者名/発表者名
      Genjo T1, Sotoma S, Tanabe R, *Igarashi R, Shirakawa M.
    • 雑誌名

      Anal Sci.

      巻: 32 ページ: 1165~1170

    • DOI

      10.2116/analsci.32.1165

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] ダイヤモンドNV中心を使った量子センシングの分子・細胞生物学への応用2017

    • 著者名/発表者名
      白川 昌宏
    • 学会等名
      第64回応用物理学会春季学術講演会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2017-03-25 – 2017-03-25
    • 招待講演
  • [学会発表] 生体分子間の非共有結合相互作用に関する物理的化学的研究2017

    • 著者名/発表者名
      白川 昌宏
    • 学会等名
      日本学術会議 薬学委員会 化学・物理系薬学分科会、生物系薬学分科会、日本薬学会シンポジウム『新しい展開を目指す化学・物理系薬学領域の研究』
    • 発表場所
      東京
    • 年月日
      2017-03-15 – 2017-03-15
    • 招待講演
  • [学会発表] 生細胞または生体における生体分子の量子センシング2017

    • 著者名/発表者名
      白川 昌宏
    • 学会等名
      ミニシンポジウム 生命科学・量子技術・ナノエレ・研究の融合 Interdisciplinary field : 「Life science」-「Quantum technology」-「Nano electronics」
    • 発表場所
      東京
    • 年月日
      2017-02-28 – 2017-02-28
    • 招待講演
  • [学会発表] 光検出磁気共鳴法を使った高分解能イメージング2016

    • 著者名/発表者名
      白川 昌宏
    • 学会等名
      第39回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2016-12-01 – 2016-12-01
    • 招待講演
  • [学会発表] ナノダイアモンド標識による蛋白質構造解析2016

    • 著者名/発表者名
      白川 昌宏
    • 学会等名
      第55回電子スピンサイエンス学会
    • 発表場所
      大阪
    • 年月日
      2016-11-11 – 2016-11-11
    • 招待講演
  • [学会発表] Cell Biology using nanogyroscope by optically detected magnetic resonance(ODMR) spectroscopy2016

    • 著者名/発表者名
      白川 昌宏
    • 学会等名
      The 21th International Conference on Magnetic Resonance in Biolgical Systemes(ICMRBS
    • 発表場所
      京都
    • 年月日
      2016-08-21 – 2016-08-25
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Actions of cellular macromolecules observed by magnetic resonance spectroscopy2016

    • 著者名/発表者名
      白川 昌宏
    • 学会等名
      大阪大学 国際蛋白研究所セミナー”Protein NMR Beyond”
    • 発表場所
      大阪
    • 年月日
      2016-06-03 – 2016-06-03
    • 招待講演

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公開日: 2018-01-16  

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