計画研究
生細胞中における細胞内蛋白質・小器官や生体膜の立体構造・運動性・超分子複合体形成等の解明するため、これらの分子・分子集合体を生細胞中で計測する手法と細胞中での力学的環境の影響を解析する手法の開発を進めた。手法は、細胞内の特定の蛋白質の高次元NMR測定であるin-cell NMR法、ダイアモンドナノ粒子(ND)をプローブ粒子とする光検出磁気共鳴法（ODMR）、流体力学的効果の基でのNMR測定であるRheo-NMRである。in-cell NMRでは蛋白質の細胞内の回転拡散と水平拡散を計測し、巨大分子集積効果等の蛋白質の立体構造や機能に与える影響を流体力学的観点から解明する事を目指した。例えばin-cell diffusion NMRを用いた解析の結果得られた流体力学的効果を、in vitroでのRheo-NMRの実験で再現し定量的に解析するという流れが本研究の一つのアウトラインである。Rheo-NMRに関しては、ALSの原因タンパク質であるSOD1の線維化過程の解析、K48架橋型ダイユビキチンのダイナミクス解析を行った。またODMRでは、NDの姿勢の3次元決定とその変化（回転運動）により、昨年度に引き続き一分子での立体構造変化の定量的測定を目指し、これまでに細胞膜、核、ミトコンドリアなどのオルガネラ、細胞骨格線維等にターゲッティングする事に概ね成功した。さらにND粒子近傍のラジカル量・電荷等を計測するため、ダイアモンド中のNVC(-)に局在する電子の緩和時間測定について感度と精度の向上を図った。NDを、膜イオンチャネルや、ミトコンドリア、葉緑体の膜にターゲットし、膜電位、イオン量、ラジカル量等を緩和時間の変動を介して計測する手法を開発するためである。また装置の改変を手がけ、励起レーザー光をnsオーダーにパルス化し、蛍光検出を共焦点化しphoton-detectorで検出した。
2: おおむね順調に進展している
本研究では細胞内蛋白質・小器官の立体構造・運動性・超分子複合体形成等を生きた細胞の中で計測する手法の確立を目的とし、細胞内の特定の蛋白質の高次元NMR測定であるin-cell NMR法とダイアモンドナノ粒子(ND)を使った光検出磁気共鳴法（ODMR）の開発を進めた。ODMRに関する研究では、要素技術となる①測定技術、②プローブ粒子の至適化と蛋白質の標識化、③細胞へのターゲッティング、④得られた情報の処理と解釈について開発研究を行った。①に関しては、高感度化、低侵襲性化等を目的とした装置の改良、取り分け光学系検出器の感度向上と検出手法やソフトウエアの至適化により時間単位の感度向上を進めた。プローブ粒子の改善と安定供給についても近年格段に進歩し、5-100nm系の粒子が低い凝集性の基で使用できる様になりつつある。またターゲッティング手法も大きく進み、生体膜やアクチン線維にNDをターゲティングする事に成功した。特にアクチン線維へのターゲティングは、ODMRの測定により、アクチン粒子が線維長の伸縮に伴い線維軸を軸として回転すること、その運動が同一線維では同期していることを示した。これは当初に掲げた大きな目標の一つで、本研究のランドマーク的成果である。また磁気共鳴系においては、マイクロ波のパルス照射を可能になるようにハードウエアの改良と、それを利用した緩和時間測定の実験手法の導入とデータ処理技術の開発を進めた。さらに、測定手法・ソフトウエアの導入、改良に伴い、④のデータ処理技術も適時、改訂・開発を行う。流体力学的効果が蛋白質の立体構造や機能に与える影響を解析するためRheo-NMRの装置を開発し、測定を行った。安定なフォールディングから線維化する過程を実時間で検出できるため、多くの非常に興味深い結果を得た。
当初から挙げてきた研究目的達成のため、細胞内の特定の蛋白質の高次元NMR測定であるin-cell NMR法、流体力学的な環境下での試料を測定するRheo-NMRとODMRの開発を更に進め、以下の研究にも取り組む。in-cell NMRでは蛋白質の細胞内の回転拡散と水平拡散を計測し、巨大分子集積効果等の蛋白質の立体構造や機能に与える影響を、流体力学的観点から解明する。例えばin-cell diffusion NMRによる細胞内の並進拡散の、また緩和干渉実験による細胞内の回転拡散の相関時間を求める。また、Rheo-NMRによる効果を検討する。さらに、今まで軽視されがちであった低分子代謝物の影響を調べる。特に、蛋白質―蛋白質相互作用、ドメイン－ドメイン相互作用における細胞内での影響を、緩和実験や回転拡散のデータから解釈し、シミュレーションを併用してその流体力学的効果を明らかにする。蛋白質の挙動はRheo-NMRによっても検証する。なお、これらの効果はODMRを利用した細胞内局所温度の分布の解析との相関で確かめる 。ODMRでは、以下の項目を行う。①ODMRによって検出した生体高分子への外力の影響を、原子間力顕微鏡（AFM）を利用して定量的計測する。②蛋白質の振動について開発した手法を利用し、種々の細胞内蛋白質、特に細胞骨格の運動状態を定量的解析する。③細胞内の粘弾性の分布の解析、特に、細胞分化に伴う液液位相分離（LLPS）の計測し、細胞分化の機講を解明する。④ND粒子近傍のラジカル量等を計測するため、ダイアモンド中のNVC(-)に局在する電子の緩和時間測定について感度と精度の高い手法を確立して、そのセンサーを、膜イオンチャネルや、ミトコンドリア、葉緑体の膜にターゲットして、緩和時間の変動を計測することにより、目的の物理量を定量的に計測することを目指す。
すべて 2018 2017
すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 6件、 オープンアクセス 6件) 学会発表 (6件) (うち国際学会 2件、 招待講演 6件)
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