生細胞内の生命反応をリアルタイムで捉えるin-cell NMR法の開発と応用

2018 年度 実績報告書

• 研究領域: 動的構造生命科学を拓く新発想測定技術－タンパク質が動作する姿を活写する－
• 研究課題/領域番号: 26119005
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 西田 紀貴 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 准教授 (50456183)
• 研究分担者: 甲斐荘 正恒 首都大学東京, 理学研究科, 客員教授 (20137029)
• 研究期間 (年度): 2014-07-10 – 2019-03-31
• キーワード: 核磁気共鳴法 / in-cell NMR / 低分子量GTPase / バイオリアクター

研究実績の概要

昨年度までに、細胞内におけるRasの活性状態（GTP結合型割合）のin-cell NMR観測を行った結果、野生型Rasおよび発癌性変異体（G12V、G13D、Q61L）の細胞内におけるGTP結合型割合はin vitroよりも低下しており、細胞内の加水分解速度定数（khy）の上昇と、GDP-GTP交換速度定数（kex）の低下の両方が寄与していることが明らかとなった。本年度は細胞内におけるRasのGTP結合型割合に変調を与える要因を解明するため、(I)内在性GTPase活性化蛋白質（GAP）、(II)細胞内分子混雑環境の2点に着目した解析を行った。
まず、内在性GAPの寄与を定量するため、代表的なGAPであるp120およびNF1をそれぞれノックアウトした細胞をゲノム編集法により作製し、in-cell NMRによりKO細胞中におけるRasのGTP結合型割合の変化を解析した。その結果、野生型RasのGTP型割合はいずれのKO細胞中においても有意な差は観測されなかったものの、T35S変異体ではNF1KO細胞中でコントロール細胞よりも顕著なGTP結合型割合の増大が観測された。したがって、細胞内Rasの加水分解亢進におけるNF1の寄与を選択的かつ定量的に評価できることが明らかになった。
また、様々な分子クラウダ―を添加して、細胞内分子混雑環境を模倣した条件下におけるkhyならびにkexの測定を行った。その結果、グリセロール存在下ではkexが野生型および全ての変異体で顕著に低下してたことから、粘性の増大によって細胞内Rasのkexの低下が引き起こされていることが示唆された。

現在までの達成度 (段落)

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] University of Toronto(カナダ)
  • 国名: カナダ
  • 外国機関名: University of Toronto
• [雑誌論文] Isotope-Aided Methods for Biological NMR Spectroscopy: -Past, Present and Future- (2018)
  • 著者名/発表者名: Masatsune Kainosho, Yohei Miyanoiri, Mitsuhiro Takeda
  • 雑誌名: The Nuclear Magnetic Resonance Society of Japan 巻: NA ページ: 37-61
  • DOI: 10.1007/978-981-10-5966-7_2
  • 査読あり
• [雑誌論文] Stable-Isotope-Aided NMR Spectroscopy (2018)
  • 著者名/発表者名: Yohei Miyanoiri, Mitsuhiro Takeda and Masatsune Kainosho
  • 雑誌名: Modern Magnetic Resonance 巻: NA ページ: 469-486
  • DOI: 10.1007/978-3-319-28388-3_48
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Numb-Mdm2 fuzzy complex reveals an isoform-specific involvement of Numb in breast cancer chemoresistance and progression (2018)
  • 著者名/発表者名: Ivan Nicola Colaluca, Andrea Basile, Veronica D’Uva, Davide Disalvatore, Manuela Vecchi, Stefano Confalonieri, Marina Mapelli, Salvatore Peace, Pier Paolo Di Fiore, Chun-Jiun Yang, Masatsune Kainosho, Michael Sattler
  • 雑誌名: J. Cell Biol. 巻: 217 ページ: 745-762
  • DOI: 10.1083/jcb.2017.09.092
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Evolution and diversification of the plant gibberellin receptor GID1 (2018)
  • 著者名/発表者名: Hideki Yoshida, Eiichi Tanimoto, Takaaki Hirai, Yohei Miyanoiri, Rie Mitani, Mayuko Kawamura, Mitsuhiro Takeda, Sayaka Takehara, Ko Hirano, Masatsune Kainosho, Takashi Akagi, Makoto Matsuoka, and Miyako Ueguchi-Tanaka
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 巻: 115 ページ: 7844-7853
  • DOI: 10.1073/pnas.1806.041.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Perspective: Next Generation Isotope-Aided Methods for Protein NMR Spectroscopy (2018)
  • 著者名/発表者名: Masatsune Kainosho, Yohei Miyanoiri, Tsutomu Terauchi, and Mitsuhiro Takeda
  • 雑誌名: J. Biomol. NMR 巻: 71 ページ: 119-127
  • DOI: 10.1007/s10858-018-0198-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] in-cell NMR法を用いた細胞内生命反応のリアルタイム観測 (2019)
  • 著者名/発表者名: Noritaka Nishida, Ichio Shimada
  • 学会等名: よこはまNMR研究会 第62回ワークショップ
  • 招待講演
• [学会発表] Recent Advances in Isotope-Aided Methods for Studying Protein Structures and Dynamics-Historical Background and Future Perspectives (2019)
  • 著者名/発表者名: Masatsune Kainosho
  • 学会等名: Advanced Isotope Labelling Methods for Integrated Structure Biology-AILM 2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] in-cell NMR法を用いた細胞内生命現象のリアルタイム観測 (2018)
  • 著者名/発表者名: Noritaka Nishida, Ichio Shimada
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム編集技術を活用した 細胞内Rasの活性制御機構のin-cell NMR観測 (2018)
  • 著者名/発表者名: Quinci Zhao, Ryu Fujimiya, Chris Mershall, Mitsuhiko Ikura, Noritaka Nishida, Ichio Shimada
  • 学会等名: 第16回次世代を担う若手のためのフィジカル・ファーマフォーラム(PPF2018)
• [備考] 東京大学薬学部 生命物理化学教室ホームページ
  • URL: http://ishimada.f.u-tokyo.ac.jp/public_html/index_j.html