計画研究
本研究では、生育に必須のメカニズムであるSecトランスロコンを介したタンパク質の分泌過程に焦点をあてている。タンパク質の分泌過程において、タンパク質という巨大なものを輸送させるためSecタンパク質は大きな構造変化が予測されている。大腸菌などの真正細菌では、タンパク質分泌反応時にSecタンパク質が、基質タンパク質を伴った大きな構造変化を繰り返し、段階的にタンパク質の輸送が達成されるとされている。これらSecタンパク質の立体構造の情報は得られつつあるが、未だその作動メカニズムには不明な点が多い。本年度は、新たに構造を決定したSec因子の一つである膜タンパク質SecDFの動的なメカニズムを明らかにすべく、特にSecDFの解析に集中して取り組んだ。変異体を用いたタンパク質の分泌活性の測定やプロトンの透過活性の測定から、最終的にSecDFがどのようにプロトンの濃度勾配のエネルギーを利用し、どのようにタンパク質と相互作用するのかについて知見が得られたため、SecDFの機能モデルを提唱した。また、タンパク質分泌反応の時間依存的な変化を見出すため、Secタンパク質と脂質をディスク状に再構成したナノディスクの高速原子間力顕微鏡を用いた観察を進めた。より安定なナノディスクを構築することに成功し、ナノディスクに再構成されたSecタンパク質の観察は、Secタンパク質のドメイン構造の変化が見出せる分解能の動画を得た。今後、条件検討を行い具体的にどのような変化が起こっているのかを検証する。
2: おおむね順調に進展している
研究計画にそって順調に進めている。本年度は、SecDFタンパク質の高分解能の構造決定を行い動的メカニズムを提唱した。
タンパク質の分泌反応はすべての生物に保存されている基本的なメカニズムの一つである。その緻密なメカニズム解明のために、バクテリア由来のSecタンパク質の動態観察を今後、進めていく。タンパク質分泌チャネルであるSecYEGとモータータンパク質を同時にナノディスクに再構成することに成功し、高速原子間力顕微鏡の基盤の上に特異的に結合させ、その状態を観察することを可能とした。条件検討の結果、Sec因子のドメイン構造が見える分解能での解析が可能となった。今後は、ATP駆動型のモータータンパク質の動態を明らかとすべく、ATPやADPやアナログ分子を用いてSecタンパク質による分泌反応の動きを時間依存的に追跡していく。タンパク質分泌反応の動態を観察するためには、基質として用いるアンフォールドしたタンパク質も一つの重要なファクターである。これまではproOmpAを用いてきたが、近年他の研究グループが用いている別の基質タンパク質の利用も進める。本年度、SecDFの構造解析が予想以上に進展したため、SecDFもどのように基質を認識し、基質を伴った構造変化をしているのかについて高速原子間力顕微鏡等を用いた解析を進める。また、研究を進める上で安定にナノディスクを形成させるのが困難であり、多くのサンプルを消費する。同様なナノディスク様粒子を形成させるポリマーなどの開発なども進展しており、新規ポリマーを用いた解析も当研究に取り入れ動態観察を進める計画である。
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Cell Reports
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http://bsw3.naist.jp/tsukazaki/publication.html
